اندام­های آلوده کننده در قارچ­ها به چندین حالت دیده می­شوند که عبارتند از اسپورانژیوسپور، کنیدی، زئوسپور و آسکوسپور. گرچه این­ها از نظر آسیب­شناسی با هم اختلاف دارند ولی بسیاری از آنها به غیر از زئوسپور قارچ­های آبزی از نظر نحوه تماس و ورود به بدن میزبان یکسان عمل می­ کنند. نفوذ قارچ­های بیماری­زا به میزبان غالباً از طریق پوشش بدن و گاهی از طریق سوراخ­های بدن انجام می­ شود. انتقال قارچ­های بیماری­زای حشرات توسط تخم بسیار نادر است. بندپایانی مثل شته­ها که تغذیه آنها از طریق مکیدن شیره گیاهان صورت می­گیرد، معمولاًاز طریق جلد به بیماری قارچی آلوده می­شوند. اما آلودگی به بیماری­های ویروسی و باکتریایی کمتر پیش می ­آید. آلودگی قارچی در نتیجه تماس بین میزبان و اجزای آلوده کننده مثل اسپور آغاز می­ شود (بوسیاس^[۱۱۵]و پندلند، ۱۹۹۸). زئوسپور تعدادی از شبه قارچ­های آبزی از جمله شاخه Oomycota نظیر گونه­ های جنس Lagenidium spp. با بهره گرفتن از تاژک جابجا شده و می­توانند با یافتن نشانه­ های شیمیایی میزبان به طرف آن حرکت کنند. بر عکس اسپورهای بیشتر قارچ­های خشکی­زی غیر متحرّک بوده و بصورت تصادفی با میزبان تماس حاصل می­ کنند که عامل آن معمولاً باد یا عوامل دیگر می­باشد، پس از تماس با میزبان اولین قدم برای ایجاد آلودگی قارچی چسبیدن و تندش بعدی آن اسپور روی کوتیکول میزبان است (آهون منش و علوی، ۱۳۶۷).

خصوصیات فیزیکی و شیمیایی جلد میزبان سهم مهمی در اختصاصی عمل کردن بیمارگرهای قارچی از نظر چسبیدن و تندش اسپور دارد. درجه چسبندگی اسپور قارچ تحت تأثیر مواد مخاطی و شرایط فیزیکی اپرسوریوم قرار دارد و نفوذ به داخل پوشش بدن میزبان از طریق مکانیکی و با کمک لوله تندشی صورت می­گیرد. این نفوذ تحت تأثیر فشار فیزیکی و استفاده از آنزیم­هایی مثل پروتئاز و غیره انجام می­ شود. کوتیکول سخت شده میزبان در مقایسه با کوتیکول تازه تغییر جلد داده میزبان مقاومت بیشتر در برابر نفوذ قارچ دارد. به این علت حشرات پس از تغییر جلد حساسیت بیشتری نسبت به قارچ­ها دارند (موسوی، ۱۳۷۹).
تفاوت در قدرت آلوده­سازی نژادهای یک قارچ ممکن است به دلیل تفاوت در مقدار آنزیم­هایی باشد که می­توانند برای تجزیه کیتین بکار روند. تعدادی از قارچ­ها پس از ورود به هموسل حشره به سرعت تکثیر یافته و معمولا میزبان خود را می­کشند. پس از مرگ میزبان ادامه رشد قارچ بصورت گندرویی است و ادامه رشد منجر به تبدیل میسلیوم به عضوی به نام سختینه می­ شود که اندامی مقاوم و پایدار است. علاوه بر آن در بسیاری از قارچ­ها، ریسه­های رویشی از لاشه میزبان خارج شده و اگر شرایط مساعد باشد اسپورهای غیر جنسی بوجود می­آیند. این اسپورها پخش شده و بیشتر از نظر انتقال افقی بیمارگر به میزبان­های جدید نقش مهمی دارند. انتشار این اسپورها در مواردی بر اثر تحرّک و جابه جایی حشره صورت می­گیرد ولی در بیشتر مواقع وسیله انتشار آنها آب یا باد است. پراکنش موضعی اسپورها ممکن است در اثر ترکیدن اندام­های تولید اسپور صورت گیرد. حرارت مطلوب برای گسترش آلودگی­های قارچ­ها معمولاً بین ۲۰ تا ۳۰ درجه سلسیوس است. رطوبت زیاد (بیش از ۹۰%) نیز بیشتر برای جوانه زدن اسپور و همچنین تولید اسپور در سطح میزبان ضروری است (موسوی، ۱۳۷۹).
وجود لایه­ای از آب برای جوانه­زنی کنیدی در بعضی از قارچ­های ناقص ضروری ولی برای بسیاری از قارچ­های راسته انتوموفتورال نامساعد است. در شرایط مساعد کنیدی و یا سایر اسپورها به مقدار زیاد تولید می­شوند که انتشار افقی قارچ را تسهیل نموده و سبب همه­گیری بیماری می­ شود. اسپورهایی با دیواره ضخیم در شرایط نامساعد تولید می­شوند که در برابر شرایط نامساعد محیطی مقاوم هستند. این اسپورها به عامل بیماری کمک می­ کنند تا در شرایط نامطلوب تنش­های محیطی را تحمل کرده و دوره­هایی را که میزبان مناسب در اختیار آنها نباشد پشت سر بگذرانند (موسوی، ۱۳۷۹).
۲-۴-۱- مرحله بیماری­زایی (ابتلای حشره به قارچ و ایجاد بیماری)
قارچ­هایی که با حشرات رابطه اتگلی دارند به دو صورت انگل خارجی و انگل داخلی می­باشند. حالت انگل خارجی در قارچ­های راسته Laboulbeniales و رده Trichomycetes دیده می­ شود. قارچ­های انگل خارجی باعث مشکل درونی برای حشره نمی­شوند و فقط در سطح بدن میزبان فعالیت کرده و عمدتاً از طریق متلاشی کردن پوشش خارجی حشره ایجاد بیماری کرده و در نهایت میزبان خود را می­کشند. اما قارچ­های انگل داخلی به طرق مختلف نظیر متلاشی کردن پوشش خارجی حشره، نفوذ به همولنف و تکثیر، غلبه بر سیستم ایمنی حشره و … سبب ایجاد آلودگی و مرگ می­شوند. در Zygomycotina زیگوسپورها و در Ascomycotina آسکوسپورها باعث ایجاد عفونت در قسمتهای درونی بدن حشرات می­شوند. اغلب، حمله قارچ به حشره در مرحله لاروی و پورگی مؤثّّرتر از مرحله بلوغ است. در مرحله شفیرگی حشرات خیلی کم مورد حمله قرار می­گیرند و در مرحله تخم به ندرت ممکن است آلودگی اتفاق افتد (کایا^[۱۱۶]و تانادا، ۱۹۸۴).
۲-۴-۲- چسبندگی اسپورها
چسبندگی اسپورها به کوتیکول حشرات در بیشتر موارد بصورت یک مکانیسم غیر فعال صورت می­گیرد و توسط نیروهای الکترواستاتیک و یا مواد لزج که در سطح بافت حشره قرار دارند به آن متصل می­شوند. در تعدادی از قارچ­ها در سطح کنیدی ماده­ای لزج و چسبنده وجود دارد که باعث اتصال آنها به کوتیکول حشرات می­گردد مانند کنیدی قارچ­های راسته انتوموفتورال. در برخی از موارد اسپورهای چسبنده حالت اختصاصی دارند مثل قارچ M. anisopliae روی سوسک­های خانواده Scarabaeidaeو یا قارچ Conidiobolus obscures که کنیدی آنها اختصاصاً به شته­ها می­چسبند و آنها را بیمار می­ کنند، اما در اکثر موارد چسبندگی در قارچ­ها یک حالت اختصاصی نیست (کایا و تانادا، ۱۹۸۴).
۲-۴-۳- نفوذ به پوشش بدن
هنگامی که اسپورهای یک قارچ روی کوتیکول بدن حشره­ای قرار می­گیرند تحت شرایط محیطی مناسب (بطور عمده رطوبت و دمای مناسب و به صورت کمتر نور) شروع به رشد نموده و تشکیل اندامی که لوله زایا نام دارد را می­ دهند. نوک لوله تندش متورم شده و یک اندام مکنده مخصوص به نام اپرسوریوم از آن بوجود می ­آید (شجاعی، ۱۳۷۶). یک ریسه نفوذ کننده در قسمت زیرین اپرسوریوم تشکیل شده و می ­تواند به لایه­ های اپی­کوتیکول و پروکوتیکول جلد حشرات نفوذ نموده و یا فقط قادر به نفوذ به اپی­کوتیکول حشره می­باشد. این ریسه سپس به یک ریسه معمولی تبدیل شده و در جهت طولی خود رشد نموده و ریسه­های نفوذی بیشتری را ایجاد می­ کند. اگر در این مرحله حشره میزبان پوست­اندازی نماید آلودگی می ­تواند از بین برود در غیر این صورت قارچ به رشد خود ادامه داده و لایه اپیدرم جلد را مورد حمله قرار می­دهد. این مرحله متداول­ترین مرحله­ ای است که در آن مکانیسم­های دفاعی بدن حشره میزبان شروع به فعالیت نموده و بافت­هایی که مورد حمله قرار گرفته­اند با عکس­العملهای خود می­توانند عامل بیماری را در نقطه آلودگی کنترل نمایند (شجاعی، ۱۳۷۶).
بطورکلی نفوذ قارچ بیماری­زا به کوتیکول حشره به این دو عامل بستگی دارد:
وضعیت ظاهری کوتیکول حشره (ضخامت، اسکلروتینی بودن و…)
وجود مواد ضد قارچی شامل مواد سمّی و شیمیایی در پوست حشره
۲-۴-۴- نفوذ قارچ از سایر منافذ بدن
قارچ­ها می­توانند از طریق حفره دهانی، سوراخ­های تنفسی و منافذ سطحی پوست نیز به داخل بدن حشره وارد شوند. اسپورهایی که از طریق حفره دهانی به داخل لوله گوارش وارد می­شوند تا وقتی که رطوبت به حد کافی وجود دارد ممکن است جوانه بزنند. در این شرایط ممکن است مایع گوارشی آنها را از بین ببرد. نفوذ قارچ به بدن حشره از طریق لوله گوارشی در مورچه آتشی مشاهده شده است. قارچ B. bassiana چندین گونه از پشه را از طریق نفوذ به سیفون عقبی بدن لاروهایشان مورد حمله قرار می­دهد (موسوی، ۱۳۷۹).
۲-۴-۵- انباشته شدن در حفره عمومی بدن
بعد از جوانه­زنی و نفوذ به پوشش حشره، ریسه قارچ به داخل حفره عمومی بدن حشره وارد می­گردد و در صورتی که بر سیستم دفاعی بدن غالب آید معمولاً منجر به تولید بلاستوسپور یا قطعات ریسه­ای می­گردد که در داخل خون حشره گردش نموده و تکثیر می­یابند و پراکندگی در حفره عمومی و تهاجم به بافت بسته به گونه قارچ متفاوت می­باشد. قارچ­ها معمولاً به چند طریق به شرح زیر با سیستم دفاعی بدن حشرات مقابله می­ کنند:
سلول­های قارچ دارای پروتوپلاسم پیشرفته­ای هستند که برای حفره عمومی حشره ناشناخته بوده و نمی­تواند آن­ را از بین ببرد.
قارچ به محض ورورد به حفره عمومی تولید تعداد زیادی اندام شبه مخمّری می­نماید که سریعاً در تمام هموسل حشره پخش می­شوند.
قارچ تولید مواد شیمیایی سمّی می­نماید.
حشره بعد از این مرحله به اختلالات فیزیولوژیکی غیر طبیعی دچار شده و به سرعت می­میرد (موسوی، ۱۳۷۹).
۳- مواد و روش­ها
۳-۱- مکان انجام آزمایش
برای پرورش حشرات از اتاق آفات انباری واقع در گروه حشره­شناسی دانشکده­ کشاورزی و جهت انجام آزمایشات قارچی از آزمایشگاه بیماری­شناسی گروه گیاهپزشکی استفاده گردید.
۳-۲- جمع­آوری و شناسایی نمونه­ها
آفت مورد استفاده در این تحقیق سوسک چهارنقطه­ای حبوباتCallosobruchus maculatus F. از خانواده Bruchidaeاست که از حبوبات آلوده به این آفت از اتاق آفات انباری گروه حشره­شناسی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه تهیه شد.
۳-۳- پرورش سوسک چهارنقطه­ای حبوبات
برای پرورش این آفت از ظروف شیشه ­ای استوانه­ای شکل دهان گشاد به حجم ۲ لیتر و از بذور لوبیا چشم بلبلی استفاده گردید. به منظور ایجاد تهویه روی دهانه ظروف پارچه توری نصب شد. در ابتدای کار جهت از بین بردن آلودگی­های احتمالی، حشرات دیگر و کنه­ها، بذرهای لوبیا چشم بلبلی به مدت ۷۲ ساعت در فریزر با دمای ۱۰- درجه سلسیوس نگهداری شدند. پس از طی این مدت ماده غذایی مزبور بیرون آورده شد و تا زمان استفاده در یخچال با دمای ۵ درجه سلسیوس نگهداری گردید. به منظور پرورش حشرات در داخل هر ظرف، مقدار ۲۰۰ گرم بذر لوبیا چشم بلبلی ریخته شد و به طور تصادفی ۵۰ جفت حشره نر و ماده در داخل ظروف رهاسازی شدند و بر روی هر ظرف برچسب شامل اطلاعات مربوط به تاریخ و نام گونه نوشته شد. سپس ظروف پرورش به اتاق آفات انباری با دمای ۱±۲۸ درجه سلسیوس و رطوبت نسبی ۵±۶۵ درصد منتقل گردیدند. حشرات کامل پس از تخمریزی و مرگ توسط الک با سوراخ­های به قطر ۵ میلی­متر جداسازی شده و بذرهای لوبیا چشم بلبلی حاوی تخم آفت به درون ظروف پرورش برگردانده شدند ومجدداً در همان شرایط دما و رطوبت کنترل شده نگهداری شدند.
۳-۴- جمع آوری حشرات کامل یک تا سه روزه
برای تهیه­ حشرات کامل یک تا سه روزه­ی سوسک چهارنقطه­ای حبوبات، بذرهای لوبیا چشم بلبلی دارای پنجره­های شفیرگی جدا شده و در داخل شیشه­های جداگانه­ ای قرار گرفتند. بعد از ۷۲ ساعت حشرات بالغ یک تا سه روزه که از بذرهای لوبیا چشم بلبلی خارج شده بودند با کمک آسپیراتور جمع آوری گردیده و جهت انجام آزمایشات بعدی مورد استفاده قرار گرفتند.
۳-۵- تأثیر نوع مواد غذایی بر روی پارامترهای رشد و بیمارگری قارچ B. bassiana
برای بررسی احتمال تأثیر نوع مواد غذایی بر روی ویژگی­های قارچ B. bassiana محتوای کربن و نیتروژن ماده غذایی محیط کشت تغییر داده شد تا تأثیر آنها روی پارامترهای رشدی قارچ مانند میزان رشد قطری کلونی، میزان اسپورزایی، درصد جوانه­زنی کنیدیوم­ها و نیز شدّت بیمارگری (LT₅₀) آنها مورد ارزیابی قرار گیرد.
۳-۶- جدایه­های قارچی و محیط­های غذایی
چهار جدایه از قارچ B. bassiana شامل DEBI007، BEH، LRC107 و LRC137 به عنوان نماینده­های قارچ B. bassiana در این مطالعه انتخاب و مورد استفاده قرار گرفتند. قبل از شروع این آزمایشات کنیدیوم­های جدایه­های انتخاب شده روی محیط کشت (SDA) Sabouroud Dextrose Agar منتقل شدند و بعد از رشد قارچ­ها به عنوان ماده تلقیحی در آزمایشات بعدی به کار گرفته شدند. در تهیه­ محیط کشت SDA از پودر آماده­ی SDA(ساخت کارخانه Merck) استفاده شد.
جدول۳-۱- فهرست جدایه­های B. bassianaمورد آزمایش