نمودار ۲۲-۴ اثر برهمکنش محیط کشت کالوس زا و محیط کشت باززایی بر تعداد شاخساره ………………………………………….۷۲
نمودار ۲۳-۴ اثر ریزنمونه بر طول شاخساره ………………………………………………………………………………………………………………………….۷۵
نمودار ۲۴-۴ اثر محیط کشت کالوس زا بر طول شاخساره ………………………………………………………………………………………………….۷۶
نمودار ۲۵-۴ اثر محیط کشت اندام زا بر طول شاخساره ……………………………………………………………………………………………………..۷۶
نمودار ۲۶-۴ اثر برهمکنش ریزنمونه و محیط کشت کالوس زا بر طول شاخساره ………………………………………………………………۷۷
نمودار ۲۷-۴ اثر برهمکنش ریزنمونه و محیط کشت اندام زا بر طول شاخساره ………………………………………………………………….۷۸
نمودار ۲۸-۴ اثر محیط کشت کالوس زا و اندام زا بر طول شاخساره …………………………………………………………………………………..۷۹
نمودار ۲۹-۴ اثر ریزنمونه بر تعداد شاخساره در باززایی مستقیم …………………………………………………………………………………………۸۳
نمودار ۳۰-۴ اثر محیط کشت باززایی بر تعداد شاخساره در باززایی مستقیم ……………………………………………………………………..۸۳
نمودار ۳۱-۴ برهمکنش اثر ریزنمونه و محیط کشت باززایی بر تعداد شاخساره در باززایی مستقیم ………………………………….۸۴
نمودار۳۲-۴ اثر ریزنمونه بر طول شاخساره در باززایی مستقیم …………………………………………………………………………………………..۸۵
نمودار ۳۳-۴ اثر محیط کشت باززایی بر طول شاخساره در باززایی مستقیم ………………………………………………………………………۸۵
نمودار ۳۴-۴ اثر برهمکنش ریزنمونه و محیط کشت اندام زا بر طول شاخساره در باززایی مستقیم ………………………………….۸۶
نمودار۳۵-۴ اثر غلظت محیط کشت بر تعداد ریشه ……………………………………………………………………………………………………………..۸۹
نمودار ۳۶-۴ اثر غلظت هورمون بر تعداد ریشه …………………………………………………………………………………………………………………….۸۹
نمودار ۳۷-۴ اثر برهمکنش غلظت محیط کشت پایه و غلظت هورمون بر تعداد ریشه ………………………………………………………۹۰
نمودار ۳۸-۴ اثر غلظت محیط کشت بر طول ریشه ……………………………………………………………………………………………………………..۹۱
نمودار ۳۹-۴ اثر غلظت هورمون بر طول ریشه ……………………………………………………………………………………………………………………..۹۱
نمودار ۴۰-۴ اثر برهمکنش غلظت محیط کشت MS و غلظت هورمون بر طول ریشه ……………………………………………………..۹۲
نمودار ۴۱-۴ اثر بستر کشت سازگاری بر درصد زنده مانی …………………………………………………………………………………………………..۹۵
نمودار ۴۲-۴ اثر بستر کشت سازگاری بر طول شاخساره ……………………………………………………………………………………………………..۹۵
نمودار ۴۳-۴ اثر بستر کشت سازگاری بر طول ریشه ……………………………………………………………………………………………………………۹۷
فصل اول
مقدمه و اهداف
فصل اول
مقدمه و اهداف
۱-۱ مقدمه
در چند دهه گذشته با انجام تحقیقات متعدد در زمینه زیست فن آوری[۱] کشاورزی، این بخش دارای جایگاه مهم و با ارزشی شده است. این روش این امکان را فراهم می سازد که با بهره گرفتن از فنون مختلف از قبیل دست ورزی ژنتیکی[۲]، کشت بافت[۳] و کشت سلول گیاهی در شرایط درون شیشهای[۴]، گیاهانی با ساختار ژنتیکی متفاوت و در نتیجه واریتههای با عملکرد بیشتر و مقاوم به آفات و بیماریها و علف های هرز و متحمل به تنشهای محیطی، تولید نماید (چاولا[۵]، ۲۰۰۰). شیوه کشت بافت گیاهی طیف وسیعی از روشها را شامل می شود. از جمله این روشها، باززایی از بافتهای جنینی، قطعات سایر بافتها، کالوس، سلولهای جدا شده و یا پروتوپلاست را می توان نام برد. باززایی گیاهک[۶] از طریق کشت بافت یک نیاز اساسی برای استفاده ژنتیک مولکولی است. یکی از روشهای کشت بافت، باززایی گیاهکها است که از طریق تشکیل گیاهکها با القاء ساقههای نابجا[۷]، جنین های رویشی[۸] و یا جوانههای جانبی[۹] امکان پذیر می شود. در این صورت ساقههای نابجا یا جنین های رویشی از کالوس و یا به طور مستقیم از ریز نمونه بدست می آید (پیریک، ۱۹۸۵). این روش می تواند به منظور بهبود و اصلاح گیاهان[۱۰]، تولید گیاهان عاری از عوامل بیماری زا یا پاتوژن[۱۱]، نگهداری ژرم پلاسم[۱۲]، تکثیر انبوه[۱۳] و تولید و تکثیر همگروهها[۱۴] (گیاهانی با ساختار ژنتیکی یکسان) مورد استفاده قرار می گیرد (لویولا و وازکوز[۱۵]، ۲۰۰۶). روش های کشت بافت بر این حقیقت تاکید دارد که خیلی از سلول های گیاهی، پتانسیل و ظرفیت دارند که قادر به باززایی یک گیاه باشند که به آن توتی پوتنسی[۱۶] می گویند (آکین آیدو و همکاران[۱۷]، ۲۰۰۹). فاکتورهای مهمی که در کشت بافت باید مورد توجه قرار گیرند شامل موقعیت فیزیولوژی گیاه مادری، انتخاب ریزنمونه، مبدا و اندازه ریزنمونه[۱۸]، انتخاب محیط کشت مناسب برای ریزنمونه، قطبیت و تعادل هورمونی در محیط کشت می باشند.
کشت بافت شامل مراحل زیر می باشد: الف) تهیه ریزنمونه و گندزدایی ریزنمونه، ب) تولید کالوس، ج) باززایی از کالوس (باززایی غیرمستقیم)، د) ریشه زایی، ه) سازگاری و انتقال به گلخانه (تاجی و همکاران، ۲۰۰۳). کالوس، تودهای از سلولهای پارانشیمی بی شکل با دیواره سلولی نازک است که در شرایط طبیعی و یا در محیط کشت درون شیشه ای به صورت سازمان نیافته رشد می کند. هنگامی که گیاه زخمی یا بریده می شود، در محل زخم کالوس تشکیل می شود (پیریک، ۱۹۸۵). در روش باززایی غیر مستقیم عموما تولید گیاهان با واسطه کالوس صورت می گیرد. یعنی ابتدا بافت ریز نمونه وادار به تشکیل کالوس می شود و سپس از کالوس اندام زایی صورت می گیرد (شریفی و همکاران، ۱۳۸۹).
معمولا از پنج گروه تنظیم کننده های رشد گیاهی[۱۹] در کشت بافت، بیشتر از اکسینها[۲۰]، سیتوکینینها[۲۱] و جیبرلین[۲۲] استفاده می شود (شریفی و همکاران، ۱۳۸۹). پرآوری شاخه[۲۳]، یک مرحله از فرایند ریزازدیادی است که به عنوان یکی از مراحل اصلی علم بیوتکنولوژی در نظر گرفته می شود. این فرایند تولید ʾʾشاخه از جوانهʿʿ از زمان کشف سیتوکینین و ترکیبات شبه سیتوکینین از طریق ساخت مصنوعی به دست آمد (دامیانو و همکاران، ۲۰۰۰). در اندام زایی مستقیم[۲۴]، قسمتی از بافت گیاه (ریزنمونه) جدا شده و در شرایط عاری از آلودگی به محیط کشت مناسب منتقل می شود. سپس با تغییر غلظت مواد تنظیم کننده رشد در محیط کشت، اندام مورد نظر تشکیل می شود (موراشیگ [۲۵]، ۱۹۷۴).
نخود شیرین با نام علمی Lathyrus odoratus L. یک گیاه یک ساله و گلدار از تیره بقولات می باشد. این گیاه بومی ناحیه شرق مدیترانه است. Lathyrus odoratus یک گیاه بالارونده است و ارتفاع آن معمولا به ۱ تا ۲ متر می رسد که به قیم مناسب نیاز دارد. گل ها و برگ ها شبیه نخود معمولی است. برگ ها به صورت مرکب شانه ای[۲۶] با دو برگچه و یک پیچک انتهایی هستند که به دور قیم می پیچند و به بالا رفتن گیاه کمک می کند. ساقه این گیاه پهن و بالدار است. در حالت عادی در مناطق معتدله، گلها در اواخر تیرماه و اوایل مردادماه ظاهر می شوند و تا اوایل پاییز گلدهی ادامه دارد. اگر در گلخانه در مرداد کشت شود در دی و بهمن گل می دهد. گل ها معمولا به رنگ ارغوانی هستند و ۲ تا ۵/۳ سانتیمتر عرض دارند. در گونه های وحشی گلها بزرگتر و تنوع بیشتری در رنگ گل مشاهده می شود. بعضی از ارقام نخود شیرین حالت رشد پاکوتاه دارند که ارتفاع آنها به ۳۰ سانتیمتر می رسد که معمولا گلهای ساده دارند. این گیاه جهت کشت در گلدان های بزرگ و آویزان کردن در بالکنها مناسب است. بر خلاف اکثر نخودها، بذور نخود شیرین سمی هستند و دارای نئوروتوکسین[۲۷] هستند که قابل خوردن نیستند (اوچات و همکاران، ۲۰۰۷). عارضه ای که بوسیله خوردن بذر نخود شیرین ایجاد می شود اودوراتیسم[۲۸] یا لاتیریسم[۲۹] نخود شیرین نام دارد.
نخود شیرین در قرن هفدهم به عنوان یگ گل مطرح شد و کشت شد و ارقام آن به صورت تجاری قابل دسترس شد. این گونه اغلب بوسیله باغداران به جهت داشتن رنگهای زیبا و عطر دلپذیر کشت می شود که هم به عنوان گل بریدنی و هم کاشت در باغچه، حاشیه و سبدهای آویزان استفاده می شود. بهترین خصوصیت آن عطر دلپذیری و شیرینی است که سرتاسر فضای اطراف خود را معطر میکند و به همین دلیل آنرا به این اسم می نامند. گل شاخه بریده آن نیز تا حدودی مطرح شد ولی به دلیل عمر کوتاه گل شاخه بریده آن مورد استقبال قرار نگرفت ولی در ژاپن از گل شاخه بریده آن استفاده می شود. ارقامی که در تابستان گل می دهند در شمال اروپا و آمریکا محبوب تر هستند و برای آغازش گل به ۱۲ ساعت طول روز نیاز دارند ولی ارقامی که به عنوان گل شاخه بریده مطرح هستند زودتر گل می دهند و روز کوتاه هستند. در ژاپن با بهره گرفتن از تیمار سرمادهی بذر ارقام تابستانه را پیش رس می کنند (پارسونز[۳۰]، ۲۰۰۰).
جنس Lathyrus دارای چند گونه وحشی[۳۱] نخود است و با وجود اینکه پتانسیل بالایی از نظر منبع ژنتیکی برای صفات مهمی از جمله مقاومت به تنش دارند، نادیده گرفته شده اند. با این حال، گونه های تجاری مهمی در این جنس وجود دارند از جمله نخود شیرین که ارزش زینتی بالایی دارند. تحقیقات زیادی در زمینه کشت بافت در مورد نخود شیرین انجام نشده است. نخستین گزارش منتشر شده درباره کشت بافت Lathyrus odoratus، بوسیله رازدان[۳۲] و همکاران در سال ۱۹۸۰ می باشد که با بهره گرفتن از جداسازی پروتوپلاست مزوفیل برگ موفق به باززایی کالوس شدند. اوچات[۳۳] و همکاران در سال ۲۰۱۰ موفق به ازدیاد درون شیشهای نخود شیرین بوسیله شاخههای جانبی شدند و گیاهک کامل تولید کردند. در این بررسی یکی از اهداف، تولید شاخساره بود. این هدف از دو جهت بررسی شد. ۱- تولید شاخساره به روش مستقیم (کشت ریزنمونه در محیط کشت جهت تولید شاخساره) ۲- تولید شاخساره به روش غیر مستقیم که شامل کشت ریزنمونه در محیط کشت های کالوس زایی و سپس کشت قطعات کالوس در محیط کشت های تولید شاخساره است. سپس ریشه زایی شاخساره های تولید شده و تولید گیاهک کامل هدف دیگر این پژوهش بود.
اهداف اصلی:
-
- تولید کالوس و تولید گیاه کامل نخود شیرین از کالوس ( ازدیاد نخود شیرین از طریق کشت بافت).
-
- بررسی تاثیر غلظتهای مختلف تنظیم کننده های رشد گیاهی بر باززایی و معرفی مناسب ترین نوع و غلظت تنظیم کننده رشد گیاهی بر باززایی نخود شیرین.
اهداف فرعی:
-
- حفظ منابع ژنتیکی نخود شیرین از طریق کشت بافت.
-
- تولید گیاه مقاوم به تنش با بهره گرفتن از پتانسیل ژنتیکی بالای این جنس.
فصل دوم
مروری بر پژوهش ها
فصل دوم
مروری بر پژوهش ها
۱-۲ منشا و تاریخچه
نخود شیرین با نام علمی Lathyrus odoratus یک گیاه گلدار از تیره Fabaceae از زیر تیره Faboideae از طایفه Vicieae (که شامل همه لگوم های دانه دار است) است. جنس Lathyrus از واژه یونانی گرفته شده است که پیشوند La به معنی بسیار و پسوند thyros به معنی پر شور است. odoratus نیز یک واژه لاتین به معنای معطر است (فرنالد[۳۴]، ۱۹۵۰) که به این گونه نخود شیرین[۳۵] می گویند.
به طور کلی گیاهان زینتی باغچه ای[۳۶] را به سه دسته یک ساله، دو ساله و چند ساله یا دائمی تقسیم می کنند. گلهای یکساله دوره زندگی خود را طی یک فصل رشد به اتمام می رسانند. این گیاهان به دو دسته یک ساله حساس[۳۷] به سرما یا نیمه مقاوم[۳۸] و گلهای یکساله مقاوم به سرما[۳۹] تقسیم می شوند. در یکسالههای حساس بذر آنها در گلخانه کشت شده و سپس نشاء آن به زمین اصلی منتقل می شود ولی یکسالههای مقاوم مراقبت چندانی نیاز نداشته و به راحتی در هوای آزاد رشد کرده و گل می دهند (لارسون[۴۰]، ۱۹۸۰). نخود شیرین جزء گل های باغچهای یک ساله مقاوم طبقه بندی می شود. اصطلاح گیاهان باغچهای عبارت است از گیاهانی که به منظور کاشت در محوطه بیرون از ساختمان منزل و در طراحی باغچه ها، حاشیه ها و میدان های شهر مورد استفاده قرار می گیرد.
۲-۲ گسترش جغرافیایی نخود شیرین در جهان
جنس Lathyrus دارای حدود ۱۳۰ گونه است که در ۱۳ بخش[۴۱] جای گرفته اند (ویلیس[۴۲]، ۱۹۷۳). Lathyrus odoratus بومی اروپا و بیشتر در ناحیه شرق مدیترانه از سیسیل[۴۳](ایتالیا) تا کرت[۴۴](یونان) یافت شده است. این گیاه در سراسر جهان به دلیل گلهای زیبا، معطر و جذاب کشت می شود(فرنالد[۴۵]، ۱۹۵۰ و کمپبل[۴۶]، ۱۹۹۷). گونه Lathyrus odoratus در قرت هفدهم به عنوان یک گل معرفی شد. در آن زمان گلها نسبتا کوچک ولی دارای عطر زیاد و جذاب بودند. محبوبیت این گل در مناطق دیگر جهان بیشتر شد. به طوریکه در کالیفرنیا نخود شیرین به میزان زیادی تکثیر می شود و انجمن ملی نخود شیرین را نیز تاسیس کردند(کرین و لاورنس[۴۷]، ۱۹۳۸). اولین هیبرید نخود شیرین توسط بارکر در سال ۱۹۱۶ گزارش داده شد (سیدیکو و همکاران[۴۸]، ۱۹۹۶ و مرا و همکاران[۴۹]، ۲۰۰۰).
۳-۲ وضعیت نخود شیرین در ایران
