ترکیب آلدئید ها با اسید تیوباربیتوریک کمپلکس‌های رنگی ایجاد می‌کند.اندازه‌گیری شدت رنگ توسط اسپکتروفتومتر شاخصی از میزان آلدئید موجود در نمونه روغن و در نتیجه معرف پیشرفت اکسیداسیون می‌باشد.این احتمال وجود دارد که آلدئیدهای بسیاری با اسید تیوباربیتوریک واکنش دهند اما اساس این آزمایش بر مبنای واکنش مالون آلدئید با اسید تیوباربیتوریک و تولید کمپلکس قرمز رنگ می‌باشد که در طول موج ۵۳۰-۵۳۲ نانومتر اندازه‌گیری می‌شود.اندیس تیوباربیتوریک مقدار مالون آلدئیدی است که در ۱۰۰۰ گرم نمونه وجود دارد.
۲-۵-۳-اندیس آنیزیدین^[۱۱۴]
اندیس آنیزیدین مقدار آلدئیدهای (به خصوص ۲-آلکانها و ۲،۴-آلکا دی انال ها) موجود در یک نمونه روغن و چربی را تعیین می‌کند. آلدئیدها در شرایط اسیدی قادرند با ترکیبی به نام پاراآنیزیدین تولید بازهای شیف نمایند که در طول موج ۳۵۰ نانومتر دارای جذب می‌باشند.
اندیس آنیزیدین طبق قرارداد ۱۰۰ برابر جذب نوری حاصل از واکنش محلول ۱ گرم روغن در ۱۰۰ میلی‌لیتر مخلوط حلال و معرف است که در یک سل یک سانتیمتری اندازه گیری می‌شود.(۹)
۲-۵-۴-اندیس توتوکس یا عدد اکسیداسیون^[۱۱۵]
این اندیس که شامل مجموع اندیس پراکسید و آنیزیدین بوده و شاخصی از میزان اکسیداسیون اولیه و ثانویه می‌باشد بر این مبنا در برخی منابع آن‌را به عنوان اندیس اکسیداسیون کامل معرفی می‌نمایند.
عدد اکسیداسیون عبارت است از: O.V=2P.V+An. V
از طرفی مجموع اندیس پراکسید و آنیزیدین نمی‌تواند بیانگر تمامی مراحل اکسیداتیو باشد، لذا برخی آنرا به عدد توتوکس بیان می‌کنند(۶۴).
۲-۵-۵-آزمایش کرایس^[۱۱۶]
آلدئید اپی‌هیدرین^[۱۱۷] (یکی از محصولات اکسیداسیون ثانویه) قادر است با ماده‌ای به نام فلوروگلوسی در محیط اسیدی ترکیب شده و رنگ قرمز ایجاد کند. این واکنش نه تنها یک آزمون کیفی سریع می‌باشد، بلکه با ارزیابی شدت رنگ در طول موج ۵۴۰ نانومتر می‌توان به صورت کمی نیز میزان فساد را اندازه‌گیری کرد(۳۲).
۲-۵-۶-جذب در ناحیه طیف U.V^[118]
هیدروپراکسیدها در طول موج ۲۳۲ نانومتر و کتون‌ها در طول موج ۲۶۸ نانومتر دارای جذب می باشند. بدیهی است با پیشرفت اکسیداسیون میزان جذب محصولات اولیه و ثانویه اکسیداسیون در طول موج‌های مذکور تغییر می‌کند، در نتیجه می‌توان کیفیت نمونه روغن را به لحاظ فساد اکسیداتیو تعیین نمود(۶۹).
۲-۶-استخراج
۲-۶-۱- روش‌های استخراج
۲-۶-۱-۱- روش سوکسله ( استخراج با حلال)
استخراج با سوکسله، شامل استخراج یک ترکیب مشخص از بافت ماده غذایی با بهره گرفتن از یک حلال است که این حلال بایستی ماده مورد نظر را در خود حل نماید؛ در این روش ماده غذایی با حلال ترکیب شده و برای مدت مشخص در تماس با یکدیگر قرار می‌گیرند و در نهایت حلال پس از عمل استخراج، جدا می‌گردد. در مدتی که ماده غذایی با حلال در تماس است، شاهد انتقال جرم ترکیب مورد نظر از ماده غذایی به حلال می‌باشیم که این انتقال در ۳ مرحله انجام می‌گیرد:

الف) ماده در حلال حل می‌گردد؛
ب) محلول از داخل ماده غذایی به سطح حرکت می کند؛
پ) محلول در حلال پخش می‌گردد.
بنابراین، زمان استخراج بایستی به حد کافی باشد تا حلال به خوبی حداکثر مقدار ماده را استخراج نماید؛
زمان استخراج به چند عامل بستگی دارد:
حلالیت ماده در حلال؛
الف) دمای استخراج: دمای بالا باعث افزایش حلالیت ماده و همچنین افزایش سرعت انتشار می‌گردد، استخراج با حلال معمولاً در دمای محیط انجام می‌گیرد، اما ممکناست برای افزایش سرعت استخراج دمای بالا در نظر گرفته شود که در این صورت به بافت ماده غذایی صدمه وارد می‌شود.
ب) سطح تماس: سرعت انتقال جرم به طور مستقیم به سطح ماده غذای بستگی دارد بنابراین هرچه ذرات ماده غذایی ریزتر باشد سرعت استخراج افزایش می‌یابد.
ج) سرعت جریان حلال: هرچه سرعت جریان حلال بیشتر باشد، باعث کاهش لایه مرزی در سطح ماده غذایی شده و در نتیجه باعث افزایش سرعت استخراج می‌گردد.
۲-۶-۱-۲- امواج فراصوتی^[۱۱۹]
امواج فراصوتی در تعریف به امواج فشرده با فرکانس بیش از ۱۶ کیلو هرتز گفته می‌شود که این امواج توسط گوش انسان قابل تشخیص نمی‌باشند. به طور معمول، فرکانس مورد استفاده بین ۲۰ کیلو هرتز تا ۱۰ مگاهرتز می‌باشد. ارتباط مرسوم دانشمندان با امواج فراصوتی به عنوان یک وسیله‌ شناسایی بدون تأثیر بر محیط یا بافت (فرکانس بالا و قدرت پایین به عنوان مثال آزمون‌های غیر تخریبی) و همچنین تغییرات فیزیکی و شیمیایی در یک بافت (فرکانس پایین، قدرت بالا به عنوان مثال سونوشیمی) می‌باشد.(شکل۲-۲۰)
شکل۲-۲۰-دامنه امواج صوتی مختلف
قدیمی‌ترین کاربرد استفاده از فراصوت تشخیصی ‌(به منظور تشخیص بیماری) به اوایل قرن بیستم بر می‌گردد ولی کاربرد فراصوت در صنعت مربوط به دهه‌ های اخیر می‌باشد. تا دهه‌ ۱۹۶۰ از فراصوت قوی تنها در زمینه تمیز کردن سطوح و جوشکاری پلاستیک در صنایع استفاده می‌شد. اما امروزه از امواج فراصوتی در زمینه‌های مختلفی همچون الکتروشیمی،ساخت شیمیایی و استخراج مواد استفاده می‌شود. امروزه روش امواج فراصوتی به عنوان یک روش استخراجی کارا در حال گسترش است و این به دلیل کاهش زمان استخراج و همچنین افزایش راندمان استخراج می‌باشد. در استفاده از امواج صوتی هنگامی که موج صدا به محیط مایع برخورد می‌کند امواج طولی تولید شده و بنابراین نواحی متغیر فشرده شونده و منبسط شونده حاصل می‌شوند. در این نواحی به دلیل تغییرات فشار، حباب‌های گاز در محیط ایجاد می‌شوند. این حباب‌ها در طی دوره‌ منبسط شدن دارای سطح زیادی هستند که در این حالت انتشار گاز زیاد می‌شود، در مرحله بعد در اثر فشرده شدن حباب‌ها یک میعان سریع در داخل حباب رخ می‌دهد. مولکول‌های میعان شده به شدت به هم می‌خورند و امواج لرزشی ایجاد می‌شود. این امواج لرزشی نواحی با دما و فشار بالا ایجاد می‌کنند. در شکل (۲-۲۱) پدیده‌ حفر‌گی به صورت شمایی نشان داده شده است. این تغییرات ناگهانی در فشار و دماباعث تجزیه بافت، ایجاد حباب‌های هوا در مایع، نازک کردن غشاء سلولی و تولید رادیکال‌های آزاد می‌شود. عمل تجزیه بافت و متلاشی کردن آن و همچنین نازک کردن غشاء سلولی باعث شده تا از این امواج در استخراج نیز بهره‌ گرفته شود(۵۹)
شکل ۲-۲۱-شمای تشکیل پدیده حفرگی
آستانه ایجاد حفرگی در یک محیط (‌حداقل نوسان فشار مورد نیاز برای ایجاد حفرگی ) به وسیله‌ چند عامل تعیین می‌شود. این عوامل شامل مقدار گاز نامحلول، فشار هیدرواستاتیک، گرمای ویژه مایع و گاز درون حباب و نیروی کششی مایع می‌باشد. عامل بسیار مهم دیگر دما می‌باشد که با آستانه ایجاد حفرگیرابطه معکوس دارد. بسامد فراصوت استفاده شده باید زیر ۵/۲ مگا هرتز باشد،زیرا این پدیده در بسامد بالاتر از این حد ایجاد نمی‌شود.
۲-۶-۱-۲-۱-مکانیسم تاثیر‌گذاری امواج فراصوت با شدت بالا
۲-۶-۲-۱-۲-۱-کاویتاسیون
مهمترین دلیل تاثیر امواج فراصوت با شدت بالا، پدیده­ای به نام کاویتاسیون می­باشد. طبق تعریف کاویتاسیون عبارتست از تشکیل ، رشد و متلاشی شدن حباب­های کوچک در مایع در اثر ایجاد فشار منفی بزرگ. امواج فراصوت، نظیر همه امواج متشکل از چرخه­های انقباض و انبساط هستند. چرخه­های انقباض فشار مثبتی را بر مایع اعمال می­ کنند که باعث نزدیک شدن مولکولها به یکدیگر می­ شود، اما چرخه­های انبساط فشار منفی را ایجاد می­نمایند که سبب دورشدن مولکولها از یکدیگر می­گردد. در امواج فراصوت، افزایش شدت موج سبب افزایش تغییر مکان یا جابجایی ذرات می­گردد، بنابراین در حین نوسان مولکول در نتیجه کاربرد امواج، فاصله مولکولها بیشتر از فاصله بحرانی خواهد بود که برای نگهداشتن مولکولهای مایع در کنار یکدیگر ضروری است. به این ترتیب زمانی خواهد رسید که فاصله مولکولها جابجایی در حدی می­باشد که باعث خارج شدن یک مولکول از دایره ارتباطی مولکول مجاورش و ایجاد حبابمی­گردد که به این پدیده اصطلاحا˝ کاویتاسیون گفته می­ شود که در واقع معادل جوشیدن سرد است. از لحاظ تئوری عنوان می­ شود که حباب هنگامی به وجود می ­آید که فاصله مولکول­ها از یکدیگربه دو برابر شعاع واندوالسی برسد. هنگامییک مایع ایجاد حباب میکند که فشار مایع(PL )^[120] کمتر از فشار بخار مایع(PV ) باشد.همچنین با توجه به معادلات ریاضی میزان فشار منفی لازم جهت ایجاد چنین حالتی در آب خالص ۱۰۰۰۰ اتمسفر است. اما به دلیل وجود گاز یا ذرات جامد، این میزان در عمل به مراتب کمتر می­باشد. مراحل کاویتاسیون شامل: تشکیل حباب اولیه، رشد حباب و متلاشی شدن آن می باشد.
کاویتاسیون به دونوع ناپایدار و پایدار طبقه ­بندی می­گردد که ویژگیهای آنها بدین شرح است:
کاویتاسیون ناپایدار: حبابهای کاویتاسیون تهییا حاوی بخار بوده و در شدتهای بیشتر از ۱۰ بوجود می­آیند. آنها در طییک یا چندین چرخه صوتی وجود دارند. قبل از متلاشی شدن در فاز تراکم ، به حبابهای کوچک تجزیه می­شوند. اگر شعاع حبابها به اندازه کافی کوچک باشد، تحت تاثیر نیروهای بزرگ ناشی از کشش سطحی در محلول حل می­شوند. در مورد حبابهای ناپایدار فرض بر این است که زمان لازم برای انتقال جرم بوسیله انتشار گاز به داخل یا خارج حباب وجود ندارد.
کاویتاسیون پایدار: حبابهای پایه حاوی گاز و مقداری بخار می­باشند و در شدت­های پایین تشکیل می­شوند. نوسان آنها غیرخطی است و محدوده زمانی کافی برای انتشار گاز به داخل حباب وجود دارد. مکانیسم رشد میکروحبابها بر حسب پدیده انتشار توجیه می­ شود. متلاشی شدن حباب منجر به ایجاد شرایط حادی جهت انجام واکنشهای شیمیایی مختلف می­ شود.
۲-۶-۱-۲-۲- تاریخچه استفاده از اولتراسوند
کاربردهای استخراج توسط اولتراسوند (UAE^[121]) در پیشرفت صنایع غذایی و صنایع مرتبط با آن شامل مواد گیاهی، روغن، پروتئین و مواد فعال بیولوژیکی است که از گیاه بدست می ­آید و همچنین مواد حیوانی مانند پلی­فنولیک­ها، آنتوسیانین، ترکیبات معطر، پلی­ساکاریدها و مواد مؤثر دیگر که با بهره گرفتن از UAE، افزایش مقدار مواد استخراج شده، افزایش سرعت استخراج، کاهش زمان استخراج و بهبود نتایج بدست آمده، مشاهده می­ شود. اولتراسوند باعث بهبود فرآیندهای رایج استخراج شده و فرصت­های جدیدی برای استخراج اقتصادی این ترکیبات ایجاد می­ کند. رویکردهای جدیدی برای استخراج با UAE پیشنهاد شده است از قبیل:
الف) پتانسیل بالای این روش برای تغییر مواد موجود در سلول­های گیاهی طوری که باعث دسترسی بیشتری به میکرونوترینیت­ها (مواد ریزمغذی) شده و در عین حال کیفیت این مواد نیز حفظ می­ شود
ب) استخراج و ریزپوشانی^[۱۲۲] همزمان
پ) جلوگیری از واکنش­های سوند شیمیایی- رادیکالی مخصوصاً در سیستم­های آبی جهت جلوگیری از نابودی مواد فعال بیولوژیک
ت)استفاده بالقوه از سوند شیمی رادیکالی برای هیدروکسیداسیون هدفمند پلی­فنولیک­ها و کاروتنوئیدها تا بدین ترتیب فعالیت زیستی آنها افزایش یابد.
گلی و همکاران در سال ۲۰۰۵، اثر آنتی‌اکسیدانی عصاره استخراجی پوست سبز پسته را در روغن سویا بررسی کردند.این عصاره‌ها در سه سطح ppm600،۴۰۰،۲۰۰ و آنتی‌اکسیدانهای سنتزی BHT و BHA در دو سطح ppm200 و ۱۰۰ به روغن سویا اضافه گردید و اثرات آنتی‌اکسیدانی آن‌ها در مدت معینی محاسبه و عدد پراکسید و اسید تیوباربیتوریک اندازه‌گیری شد. نتایج نشان داد که غلظت ۶۰۰ ppm از عصاره به همراه غلظت ۲۰۰ ppm آنتی‌اکسیدان های سنتزی بیشترین اثر آنتی‌اکسیدانی را داشت. بدین ترتیب پوست سبز پسته به عنوان منبعی که دارای اثر آنتی‌اکسیدانی است، معرفی شد (۳۰).
سحری و همکاران در سال ۲۰۰۴، به منظور بررسی خاصیت آنتی‌اکسیدانی روغن بذر چای، این روغن را در ۲ سطح ۵ و ۱۰ درصد به روغن آفتاب‌گردان و روغن زیتون اضافه کردند و نمونه‌ها را در دمای ۶۳ درجه سانتیگراد نگهداری نموده و در فواصل زمانی معین عدد پراکسید آنها اندازه گیری شد. آنها دریافتند که این روغن دارای خاصیت آنتی‌اکسیدانی قوی بوده و در سطح ۵ درصد موجب نگهداری بهتر روغن آفتاب‌گردان می‌شود.(۶۵)
تپه و همکاران در سال ۲۰۰۵ ترکیبات اسانس Cyclotrichium& Schenge. Origanifolium را با GC/MS شناسایی و فعالیت آنتی‌اکسیدانی اسانس و عصاره آن را با بهره گرفتن از دو روش DPPH و بی‌رنگ شدن بتاکاروتن بررسی کردند و دریافتند عصاره دارای فعالیت بالاتری نسبت به اسانس است.(۸۱)
سوسی و همکاران (۲۰۰۲) خواص ضدسرطانی و آنتی‌اکسیدانی عصاره برگ حنا را مورد مطالعه قرار دادند و نشان دادند که عصاره برگ حنا دارای اثر سمیت قوی روی سلول‌های سرطانی کبد انسان می‌باشد. همچنین دارای فعالیت آنتی‌اکسیدانی در حدود ویتامین E است (۷۸).
تاکنون مقالات زیادی در رابطه با اولتراسوند به عنوان یک روش آزمایشگاهی جهت کمک به فرآیندهای استخراج مواد مؤثر گیاهی، گزارش شده است. پیش از این مقاله­هایی راجع به استخراج متابولیت­های گیاهی، استخراج فلاوونوئیدها از مواد غذایی توسط حلال­های مختلف و همچنین استخراج مواد فعال زیستی از گیاهان، منتشر شده است. با این حال مقدار اندکی مقاله راجع به توسعه مستمر فرایند اولتراسونیک و کاربردهای اولیه (راه­گشای) این تکنیک گزارش شده است.