۹-۲) پاساژ بافتی
بافتهای تثبیت شده در فرمالین دارای مقدار زیادی آب هستند که این آب می تواند در تهیه مقاطع بافتی اختلال ایجاد کند، لذا آبگیری از بافتها جهت بوجود آمدن قوام و سفتی ضروری به نظر میرسد. این اعمال طی پاساژ یا گردش بافت صورت میگیرد. مراحل پاساژ بافت عبارتند از:
١-۹-۲) آبگیری (dehydration)
برای آبگیری از الکل اتانول با غلظتهای صعودی به شرح زیر استفاده شد:
١- الکل ٧٠ درجه ١ ساعت
٢- الکل ٨٠ درجه ١ ساعت
٣- الکل ٩٠ درجه ۵/١ ساعت
۴- الکل مطلق I ١ ساعت
۵- الکل مطلق II ١ ساعت
٢-۹-۲) شفافسازی (clearing)
این مرحله به منظور زدودن کدورت و افزایش شفافیت بافت میباشد. گزیلول (زایلین) به عنوان ماده شفاف کننده استفاده می شود. زیرا این ماده هم در الکل و هم در پارافین قابل اختلاط است و به برداشتن یا تمیز کردن الکل کمک می کند و چون مادهای فرار است با قرار گرفتن در حمام پارافین به آسانی تبخیر شده و پارافین مایع جای آن را میگیرد.
مراحل شفافسازی به صورت ذیل انجام گرفت:
١- محلول گزیلول + روغن سدر ١ شب
٢- محلول گزیلول ١ ساعت
٣-۹-۲- نفوذ و آغشتگی
در این مرحله برای نفوذ و آغشتگی، بافتها به یک حمام پارافین در یک کوره با دمای Cº۶۰-۵۶ (دمای ذوب پارافین) منتقل شدند. در حین این عمل گزیلل از بافتها با پدیده انتشار خارج شده و تبخیر میگردد و متعاقب آن پارافین برای جانشین شدن گزیلل به داخل بافت انتشار مییابد.
مراحل آغشتگی به صورت ذیل انجام گرفت:
١- پارافین مذاب ١ساعت
٢- پارافین مذاب II ١ساعت
٣- پارافین مذاب III ٢ ساعت
۴-۹-۲) قالبگیری
بعد از اینکه بافتها مراحل ثبوت و پاساژ بافتی را گذراندند. برای تهیه مقاطع میکروسکوپی لازم است که این قطعات در بلوکهای پارافینی قالبگیری شوند و برای برش توسط میکروتوم آماده شوند. برای قالبگیری ابتدا لازم است که پارافین را ذوب نموده و در داخل قالبهای مخصوص ریخته و سپس بافت را بوسیله یک پنس گرم برداشته و در پارافین مذاب قرار دهیم به طوری که سطح برش به طرف کف ظرف قرار گیرد. به منظور شناسایی نمونهها، بر روی هر یک از بلوکهای پارافینی تهیه شده، شماره یا نام مربوط به هر نمونه را با مداد نوشته و نصب می شود. پس از سرد شدن پارافین و منجمد شدن آن قالبها را جدا کرده و بلوکهای پارافینی جهت نگهداری به یخچال منتقل گردیدند.
۵-۹-۲) برش بافت و ثابت کردن مقاطع بافتی بر روی لام
در این مرحله قالبهای پارافینی را از یخچال خارج کرده و با بهره گرفتن از دستگاه میکروتوم دوار برشهایی با ضخامت ۵ تا ٧ میکرون از بافت مورد نظر تهیه می شود. برشهای حاصل را به حمام آب گرم با دمای Cº۴۵ منتقل کرده و با این کار چین خوردگیهایی که حین برش بوجود آمده بود از بین میروند. برای چسباندن نمونهها به لام از چسب آلبومین استفاده میکنیم. سپس لامها به مدت ٢۴ ساعت در هوای آزمایشگاه باقی ماندند تا کاملأ خشک شوند.
۶-۹-۲) طرز تهیه چسب آلبومین
سفیده تخممرغ و گلیسرول را به نسبت مساوی با هم مخلوط کرده و یک قطعه تیمول به عنوان محافظ برای جلوگیری از رشد باکتری ها و قارچها به آن اضافه می شود. بعد از آماده نمودن محلول آلبومین، لامهای تمیز و خشک را برداشته یک قطره از محلول را روی هر یک از آنها قرار داده، بعد با نوک انگشت آن را در سطح لام پخش می شود. بعد از آماده شدن لامها، مقاطع بافتی را که در حمام آب گرم شناور هستند به روی لامها منتقل نمودند. اکنون لامها برای رنگآمیزی آماده هستند.
۱۰-۲) رنگ آمیزی مقاطع بافتی
برای بررسی خصوصیات فیزیکی اجزاء سلولی و ارتباطات بافتها، برشهای مورد نظر باید مورد رنگآمیزی قرار گیرند. اما قبل از انجام رنگآمیزی باید پارافین از مقطع روی اسلاید برداشته شود. برای این منظور و آبدهی به بافتها، اسلایدها را به ترتیب از محلولهای ذیل عبور میدهیم.
١- محلول گزیلل I ٣ دقیقه
٢- محلول گزیلل II ٣ دقیقه
٣- محلول گزیلول III ٣ دقیقه
۴- الکل ۹۶ درجه ۳ دقیقه
۵- الکل ٩٠ درجه ٣ دقیقه
۶- الکل ٨٠ درجه ٣ دقیقه
٧- الکل ٧٠ درجه ٣ دقیقه
بدین ترتیب مقاطع برای رنگآمیزی آماده میگردند.
۱۱-۲) رنگآمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E)
جهت انجام این رنگآمیزی، لامهای آماده شده در مراحل قبل را به ترتیب از محلولهای ذیل عبور میدهیم.
١- محلول هماتوکسیلین هاریس ١٣-١٠ دقیقه
٢- شستشو در آب جاری
٣- محلول اسید – الکل ٣ ثانیه
۴- شستشو در آب جاری
۵- محلول کربنات لیتیوم اشباع ۵-٣ دقیقه
۶- شستشو در آب جاری
٧- محلول ائوزین ٧ دقیقه
٨- شستشو در آب جاری
٩- الکل ٧٠ درجه ٠-١۵ ثانیه
١٠- الکل ٨٠ درجه ۴۵-٣٠ ثانیه
١١- الکل ٩٠ درجه ٣ دقیقه
١٢- الکل ۹۶ درجه ٣ دقیقه
١٣- محلول گزیلل I ٣ دقیقه
١۴- محلول گزیلل II ٣ دقیقه
١۵- محلول گزیلل III ٣ دقیقه
١-۱۱-۲) طرز تهیه اسید الکل
برای تهیه اسید الکل ١٠٠ میلیلیتر الکل اتیلیک ٧٠ درجه با ١٠ میلیلیتر اسید کلریدریک غلیظ مخلوط شد.
٢-۱۱-۲) طرز تهیه رنگ ائوزین
برای تهیه محلول رنگ ائوزین، یک گرم ائوزین در ١٠٠ میلیلیتر آب مقطر حل شده و یک قطعه تیمول به عنوان محافظ به آن افزوده شد.