گروه تجربی ۳: میزان ۱ میلی لیتر محلول تتراکلریدکربن و روغن زیتون (به نسبت ۱:۱) به ازاء هر کیلوگرم وزن حیوان به صورت درون صفاقی، هفته ای ۲ بار دریافت کردند، به علاوه اینکه روزانه
cc2/0 عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس با دوز mg/kg/cc600 به صورت گاواژ دریافت نمودند.
شکل(۲-۴): طرز گاواژ
۲-۷- روش دادن عصاره به حیوان
موش هایی که وزن بین ۱۸۰ تا ۲۰۰ گرم داشتند، دوزهای mg/kg/cc 200 ،۴۰۰ ، ۶۰۰ عصاره دریافت کردند (۶۸).
۲-۸- روش تجویز دارو
برای این کار از سرنگ انسولین و سرنگ cc2 با سوزن ۲۵ استفاده می‌شد. در هر هفته ۲ بار، راس ساعت ۸ صبح تزریق انجام می گرفت. چون روغن زیتون به علت غلظت زیاد توسط سرنگ انسولین تزریق نمی شود، در گروه کنترل از سرنگ cc2 با سوزن ۲۵ استفاده می شود. اما در بقیه گروه ها چون تتراکلرید کربن نیز در روغن زیتون حل شده است محلول روان تر و رقیق تر می شود و از سوزن سرنگ انسولین عبور می کند.

تزریق به صورتی انجام می گرفت که سطح شکمی و پای موش به سمت بالا قرار می‌گرفت و یکی از پاهای موش مهار گردیده و در ناحیه کشاله ران تزریق به صورت داخل صفاقی^[۷۵] انجام می‌شد. در این تحقیق گروه های شاهد و گروه های تجربی همه مقدار محلول روغن زیتون و تتراکلرید کربن را به صورت درون صفاقی دریافت می کردند. اما دادن داروها، ظهرها هر روز راس ساعت ۱۲ انجام می شد. علت ناهمزمانی تزریقات و دادن داروها کمتر شدن استرس حیوانات می باشد.
شکل(۲-۵): نحوه تزریق تتراکلریدکربن و روغن زیتون
۲-۸-خونگیری از قلب
پس از تجویز عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس به گروه های تجربی برای مدت ۴۰ روز، در پایان روز چهلم حدفاصل ساعت ۸-۵/۹ صبح از قلب خونگیری به عمل آمد. پس از دوره چهل روزه به وسیله بیهوشی خفیف موش ها، با اتر به منظور ارزیابی فعالیت آنزیم های کبدی (ALP , AST , ALT) و آلبومین و بیلی روبین (توتال و مستقیم) سرم، ml3 از قلب خونگیری به عمل آمد.
سپس نمونه های خون را برای جدا نمودن سرم از بخش های دیگر به مدت ۵ دقیقه توسط دستگاه سانتریفوژ با دور ۳۰۰۰ بار در دقیقه سانتریفیوژ کرده سرم جدا شده که در قسمت بالای لوله قرار دارد توسط پی پت برداشته و به لوله دیگری منتقل و با پارافیلم روی لوله را پوشانده و تا زمان انجام سنجش های آنزیمی به صورت منجمد نگهداری شد.
۲-۹- روش تعیین فعالیت آنزیم آسپارتات آمنیوترانسفراز (AST/GOT) و آنزیم آلانین آمینوترانسفراز (GPT/ALT)
برای تهیه محلول معرف، ‌محلول Reagent شماره ۱ و ۲ را به نسبت ۴+۱ با یکدیگر مخلوط کرده، ‌سپس مقدار لازم از سرم خون را برداشته و یک دقیقه بعد از مخلوط نمودن و تاباندن طول موج مناسب،‌ مقدار جذب نوری را تعیین نموده و دقیقاً بعد از ۱و۲و۳ دقیقه اختلاف جذب نوری از دقیقه قبل را مشخص نموده و آنها را با هم جمع و بر عدد سه تقسیم کرده،‌ میانگین بدست آمده را در عدد ۱۹۸۵ ضرب نموده. محلول Reagent شماره ۱و۲ به صورت جدا از هم نگهداری می شوند زیرا هنگامی که با هم ترکیب می شوند، نیمه عمرش کاهش می‌یابد. دوام محلول‌ها پس از مخلوط شدن در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی گراد ۳۰ روز در دمای ۱۵ تا ۲۵ درجه سانتی گراد ۵ روز می باشد (۹۹) .
اساس آزمایش ALT به صورت زیر است:
L- Alanine + 2 –oxoglutarate← ALT →L- Glutamate + Pyruvate
Pyruvate + NADH + H⁺← LDH → D- lactate + NAD⁺
اساس آزمایشAST به صورت زیر است:
L- Aspartate oxaloacetate← AST → L- Glutamate + oxaloacetate
Oxaloacetate + NADH + H⁺ ← MDH → L- malate + NAD⁺
۲-۱۰- روش تعیین فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز (ALP)
برای تعیین فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز، تمام مراحل به کار رفته در مورد آنزیم ALP , AST انجام می شود، با این تفاوت که در انتهای کار میانگین بدست آمده را در عدد ۲۷۵۷ ضرب کرده (۹۶) و به دلیل آنکه ماده زمینه ای طبیعی موجود آلکالین فسفاتاز تاکنون شناخته نشده است، جهت اندازه گیری آن از ماده زمینه ای سنتزی مانند الفا- نیتروفنیل فسفات استفاده می شود (۹۶و۹۷).
اساس آزمایش به صورت زیر است:
P- Nitrophenyl Phosphate + H2O ← ALP → Phosphate + P- Nitrophenol
۲-۱۱- روش تعیین میزان آلبومین و بیلی روبین در سرم خون
در تعیین میزان پروتئین برای تهیه محلول معرف، محلول Reagent شماره ۱و۲ رابه نسبت ۴+۱ با یکدیگر ترکیب کرده سپس یک میلی متر محلول معرف آماده شده را در داخل کووت ریخته و ۱۰ میکرولیتر استاندارد سرم به آن افزوده و طول موج مناسب را تابانده و پس از یک دقیقه، مقدار جذب نوری را قرائت نموده و کرونومتر را به کار انداخته و دقیقاً پس از یک دقیقه مقدار جذب نوری را دوباره قرائت کرده و با بهره گرفتن از فرمول زیر مقدار ماده مورد نظر در سرم را بدست آورده (۷۲).
اساس آزمایش در تعیین میزان پروتئینها این است که پروتئینها در محیط قلیایی با یون های مس و تارتات تشکیل یک کمپلکس لاجوردی رنگ را سبب می شوند (۷۲).
در تعیین میزان آلبومین و بیلی روبین محلولهای Reagent شماره یک و دو را به صورت آماده در داخل کیت قرار داد.
در مورد آلبومین ۵ دقیقه پس از مخلوط کردن جذب نوری استاندارد و نمونه ها را اندازه گیری نموده. جذب نوری در مدت ۳۰ دقیقه ثابت باقی می ماند که در این مدت باید اندازه گیری انجام شود. سپس از فرمول زیر مقدار آلبومین موجود در نمونه را بدست آورد:
در آزمایش تعیین میزان آلبومین اساس آزمایش ایجاد کمپلکس رنگی آلبومین با برم کرزول کرین می باشد.
در مورد بیلی روبین پس از مخلوط نمودن و تاباندن طول موج مناسب در ۳۷ درجه سانتی گراد دقیقاً پس از ۱۰ دقیقه جذب نوری، نمونه ها و استاندارد را برای بار دوم در مقابل شاهد قرائت نموده، سپس مقدار بیلی روین موجود در نمونه را از فرمول زیر به دست آورده:
مقدار بیلی روبین در نمونه =
۲-۱۲-روش های تجزیه و تحلیل آماری
میانگین بدست آمده از اندازه‌گیری میزان فاکتورهای بیوشیمیایی سرم خون و فعالیت آنزیم‌های کبدی در گروه های مختلف از طریق روش ANOVA و T-test مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت. شدت آماری استفاده شده در مطالعه حاضر آزمون دانکن و در این مطالعه سطح معنی دار (۰۵/۰ P≤) در نظر گرفته شده است .
میانگین حاصل ازنتایج بدست آمده از اندازه‌گیری میزان فاکتورهای بیوشیمیایی خون و فعالیت آنزیم‌های کبدی در جدول مربوط ثبت گردیده است.
فصل سوم:
نتایج
۳-۱- نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم AST در گروه های آزمایشی
ابتدا با بهره گرفتن از آزمون Independent-sample T- Test میانگین غلظت این آنزیم را در گروه کنترل و شاهد به صورت دو به دو مقایسه می کنیم، مقایسه نتایج آزمون آماری مربوط به میزان فعالیت آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) نشان دهنده این است که بین گروه شاهد و کنترل تفاوت معنی داری در سطح ۰۰۱/۰ P≤ وجود دارد(جدول و نمودار۳-۱). حال با بهره گرفتن از آزمون پارامتری ANOVA و post hoc دانکن اختلاف معنی دار، مابین گروه شاهد و دیگر گروه ها را بررسی می کنیم. بنابراین با توجه به جدول و نمودار ۳-۲ افزایش معنی داری در غلظت آنزیم AST در گروه دریافت کننده CCl₄ و گروه دریافت کننده عصاره کرفس با دوز mg/kg/cc 200 نسبت به سایرگروه ها وجود دارد. در گروه های دریافت کننده عصاره کرفس با دوز mg/kg/cc 400 و ۶۰۰ مقدار آنزیم فوق به حد گروه کنترل رسیده است.
جدول ۳-۱ مقایسه میانگین غلظت آنزیم AST در گروه کنترل و شاهد