شکل ۳-۷ هضم آنزیمی pHan-gcsf
چاهک ۳-۱: کلون شماره ۳ هضم شده با BamHI، EcoRI و HpaI (به فرم خطی حدوداً ۷۰۰۰ نوکلئوتیدی)
چاهک ۴: کلون شماره ۳ هضم نشده
چاهک ۵: مارکر DNA (kb1)
چاهک ۸-۶: کلون شماره ۴ هضم شده با BamHI، EcoRI و HpaI (به فرم خطی حدوداً ۷۰۰۰ نوکلئوتیدی)
چاهک ۹: کلون شماره ۴ هضم نشده
چاهک ۱۰ و ۱۱: کلون شماره ۸ هضم شده با BamHI و HpaI (به فرم خطی حدوداً ۷۰۰۰ نوکلئوتیدی)
چاهک ۴: کلون شماره ۸ هضم نشده
۳-۳ کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf
۳-۳-۱ PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble)
با بهره گرفتن از نرم افزار generunnr پرایمرهای اختصاصی جهت تکثیر ژن زئوسین از وکتور بیانی pPICZα طراحی گردید و در انتهای این دو پرایمر جایگاه برشی آنزیم BglII قرار داده شد (شکل ۳-۸).

(الف) (ب)
شکل ۳-۸ بررسی توالی پرایمرهای F (الف) و R (ب) ژن zeocin.
PCR گرادیان بر روی وکتور pPICZα با بهره گرفتن از پرایمرهای طراحی شده بر روی ژل آگارز ۱% باند حدوداً ۱۲۰۰ نوکلئوتیدی را نشان داد که بهترین دمای مشاهده شده ۶۰ درجه در نظر گرفته شد (شکل۳-۹).
۱ ۲ ۳ ۴ ۵ ۶ ۷
شکل ۳-۹ PCR گرادیان ژن مقاومت به zeocin
چاهک ۷-۱: محصول PCR در دماهای ۵۰ تا ۶۰ درجه سانتی گراد
چاهک ۵: مارکر DNA (kb1)
۳-۳-۲ کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy
محصول PCR ژن زئوسین پس از تخلیص از ژل آگارز در وکتور کلونینگ خطی pGEM T easy کلون گردید و کلنیهای سفید نوترکیب رشد کرده بر روی پلیت LB آگار حاوی X-gal و IPTG مورد بررسی بیشتر قرار گرفتند.
۳-۳-۳ تأیید کلون های نوترکیب pGEM-zeocin
۳-۳-۳-۱ بررسی سریع کلونهای نوترکیب
۷۰% هر یک از کلنی های سفید به روش quick check مورد بررسی قرار گرفت (شکل ۳-۱۰).
۱ ۲ ۳ ۴ ۵ ۶ ۷ ۸ ۹ ۱۰
شکل ۳-۱۰ بررسی سریع کلونهای نوترکیب pGEM-zeocin
چاهک ۱: کلون آبی رنگ بر روی پلیت ماتریکس (pGEM فاقد ژن الحاقی)
چاهک های ۱۰-۲: کلونهای مشکوک در مقایسه با وکتور pGEM بدون ژن الحاقی
۳-۳-۳-۲ هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب pGEM-zeo با BglII
برای تأیید بیشتر، از کلون های مورد نظر استخراج پلاسمید صورت گرفت و پلاسمیدها با BglIIمورد هضم آنزیمی قرار گرفتند که محصول این هضم بر روی ژل آگارز ۱% مشاهده گردید (شکل ۳-۱۱).

۱ ۲ ۳ ۴ ۵ ۶ ۷ ۸ ۹ ۱۰ ۱۱ ۱۲
شکل ۳-۱۱ هضم آنزیمی پلاسمیدهای نوترکیب pGEM-zeo با BglII
چاهک ۱، ۵: کلون های نوترکیب هضم نشده
چاهک های ۴-۲ و ۱۰-۶: وکتورهای نوترکیب هضم شده با BglII (قطعه ۱۲۰۰ نوکلئوتیدی زئوسین و وکتور pGEM 2900 بازی)
چاهک ۱۱ و ۱۲: وکتور pGEM هضم نشده و هضم شده با BglII (بدون جایگاه برش)
چاهک۷: مارکر DNA (kb1)
۳-۳-۴ کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf
پس از تأیید وجود قطعه ژنی زئوسین به طول تقریبی bp1200 در وکتور pGEM، این وکتور و نیز وکتور بیانی pHan-gcsf با آنزیم BglII، که جایگاه برش آن¬ در دو انتهای قطعه ژنی زئوسین و نیز بر روی وکتور بیانی در نظر گرفته شده بود، مورد هضم آنزیمی قرار گرفته و پس از تخلیص قطعات از ژل، لیگاسیون آنها انجام شده و محصول لیگاسیون به سلول‌های مستعد E. coli منتقل شده و غربالگری کلونهای رشد یافته بر روی محیط LB آگار حاوی زئوسین صورت گرفت.
۳-۳-۵ بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin
۳-۳-۵-۱ بررسی سریع کلونهای نوترکیب
کلونهای رشد یافته بر روی پلیت حاوی زئوسین به منظور بررسی الحاق قطعه ژنی مقاومت به زئوسین بر روی ژل آگارز برده شدند (شکل۳ -۱۲) و در نهایت بر روی کلون های سنگین تر PCR ژن gcsf انجام شد.
۱ ۲ ۳ ۴ ۵ ۶ ۷ ۸ ۹ ۱۰ ۱۱ ۱۲
شکل ۳-۱۲ بررسی سریع کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeo
چاهک ۱۲-۱: کلونهای مختلف رشد یافته بر روی پلیت حاوی زئوسین
۳-۳-۵-۲ بررسی کلونها به روش Colony-PCR
کلونهایی که با روش فوق سنگینتر تشخیص داده شدند تحت PCR اختصاصی ژن gcsf قرار گرفتند (شکل۳-۱۳).
۱۵ ۱۴ ۱۳ ۱۲ ۱۱ ۱۰ ۹ ۸ ۷ ۶ ۵ ۴ ۳ ۲ ۱
شکل۳-۱۳ PCR ژن gcsf بر روی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeo