۱-۲-۸- نشانگر مولکولی
نشانگر­های مولکولی فراوان و در هر موجود زنده­ای مورد استفاده قرار می­گیرند. اگر­چه پتانسیل نشانگر­های مولکولی برای اصلاح کنندگان از حدود ۷۵ سال پیش شناخته شده بود، ولی کاربرد آن­ها تا حدود ۳۰ سال پیش به دلیل نبود نشانگر­های مناسب بسیار محدود بوده است. گسترش نشانگر­های DNA موجب به­ کارگیری روش­های بسیاری برای غلبه بر مشکلات اصلاحی و ژنتیکی موجود شده است. در سال­های گذشته، از نشانگر­های DNA برای مطالعات پایه­ای و کاربردی در انسان، حیوان و گیاه استفاده شده است (دهداری، ۱۳۸۹).

از طرف دیگرکشف انواع مختلف آنزیم­ های محدود­گر توسط اسمیت^[۹۳] (۱۹۷۰)، همچنین کشف واکنش زنجیره­ای پلی­مراز (پی.سی.آر) توسط مولیس و فالونا^[۹۴] (۱۹۸۷) فرصت مناسب را برای بررسی تنوع و تفاوت موجودات مختلف در سطح DNA امکان­ پذیر کرده است. توسعه نشانگر­های مولکولی DNA عصر جدیدی را در علم ژنتیک گشوده است، به­ طوری که به کمک این نشانگر­ها ایجاد نقشه­های فیزیکی و ژنتیکی در موجودات زنده و هم­چنین شناسایی ژن­های کنترل­ کننده صفات کیفی و کمی امکان­ پذیر شده است (دهداری، ۱۳۸۹).
تاکنون تعداد زیادی از نشانگر­های DNA معرفی شده ­اند و در تجزیه­های ژنتیک موجودات مورد استفاده قرار گرفته­اند. این نشانگر­ها از نظر بسیاری از ویژگی­ها مانند درجه­ چندشکلی، غالب یا هم­بارز بودن، تعداد جایگاه تجزیه شده در هر آزمایش، توزیع در سطح کروموزوم، تکرارپذیری، نیاز یا عدم نیاز به توالی­یابی DNA الگو و هزینه­ های مورد نیاز با همدیگر متفاوت­اند. انتخاب بهترین نشانگر به هدف مطالعه (انگشت ­نگاری، تهیه­ نقشه­ی پیوستگی، ژنتیک جمعیت و روابط تکاملی) و سطح پلوئیدی موجود مورد مطالعه بستگی دارد (نقوی و همکاران، ۱۳۸۴).
کاوشگر­های مولکولی قطعات کوچکDNA یا RNA هستند که DNA بخصوصی را در داخل یک مخلوط پیچیده شناسایی می­ کنند. این موضوع به واسطه­ جفت شدن DNA با رشته مکمل آن امکان پذیر است. حتی در یک ژنوم بسیار بزرگ، کاوشگر فقط با توالی مکمل خود و نه جای دیگر جفت می­ شود. با توجه به اینکه کاوشگر با یک ماده رادیو­اکتیو یا شیمیایی نشان­دار می­ شود، در نتیجه قطعه مورد نظر قابل شناسایی خواهد بود. به طور معمول کاوشگر­ها از دو منبع به دست می­آیند، کاوشگر­های حاصل از DNA­ی ژنومی(gDNA)^[95] و کاوشگر­های حاصل از DNA­ی مکمل^[۹۶] (cDNA) (بی­همتا و همکاران، ۱۳۸۸).
کاوشگر­های حاصل از DNA ژنومی، با هضم کامل DNAژنوم هسته­ی گونه­ مورد بررسی با بهره گرفتن از یک آنزیم برشی به­دست می­آیند. به منظور تهیه قطعاتی که طول آن­ها با روش همسانه­سازی یا تکثیر آزمایشگاهی متناسب باشد، به­ طور معمول آنزیم با جایگاه تشخیص ۶ باز انتخاب می­ شود. اما ژنوم گونه­ های گیاهان عالی دارای مقدار زیادی DNA­ی تکراری است. بعلاوه این DNA اغلب بیان نمی­ شود، در نتیجه روش مورد استفاده، قطعات زاید زیادی تولید می­ کند که اغلب آن­ها با ژن مرتبط نیستند. به منظور رفع این مشکل از آنزیم­ های حساس به متیل­گذاری استفاده می­ شود. فرض بر این است که نواحی فعال بیان شده در مقایسه با نواحی تکراری که اغلب خاموش­اند، بسیار کمتر متیله می­شوند. آنزیمی مانند pstІ در نواحی تکراری متیل شده قطعات بسیار بزرگ و در نواحی که دارای ژن­هایی با توالی­های به ندرت تکراری یا غیر تکراری هستند، قطعات کوچکتر تولید می­ کند.
کاوشگر cDNA مربوط به ژن­های بیان شده هستند. RNA­ی پیغام­بر (mRNA) از اندام مورد نظر استخراج می­شوند، DNA مکمل آن­ها به وسیله آنزیم رونوشت­بردار سنتز می­ شود و cDNA­­ی کلون شده به عنوان کاوشگر استفاده می­شوند. در مقایسه با کاوشگر­های DNA ژنومی، CDNAدر واقع نسبت زیادی از جایگاه­های ژنی منحصر به فرد را که مختص آن گونه هستند را آشکار می­ کند (نقوی و همکاران، ۱۳۸۴).
در سال­های اخیر این تکنیک­های مولکولی، روش­های ارزشمندی می­باشند که ارتباط ژنتیکی بین و داخل گونه­ ها را تعیین می­ کند (پتیت^[۹۷] و همکاران، ۱۹۹۳). همچنین این فرض است که نشانگر­های مولکولی می­توانند برای تعیین صفات ارثی کمی استفاده شوند. این صفات کمی شامل ارتفاع نهال، وزن خشک ریشه، وزن خشک ساقه، قطر ساقه و غیره می­باشند، اما صفات سازگاری شامل انداز­گیری­های مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی پس از تنش می­باشند (بنوسزا و الکاسبی^[۹۸]، ۱۹۹۹). در میان ویژگی­های سازگاری عملکرد رشد و زنده­مانی دو پارامتر مهم می­باشند (بنوسزا و همکاران، ۲۰۰۱). همچنین نشانگر مولکولی می ­تواند حوادث تاریخی و عملکرد اجبار­های تکاملی طولانی مدت را نشان دهند، در حالی­که ویژگی­های سازگاری در اثر فشار انتخاب طبیعی ظاهر می­شوند. از طرف دیگر ویژگی­های سازگاری و ویژگی­های کمی مرتبط با رشد فنولوژی یا مقاومت با تنش در مورد گونه­ های درختان جنگلی و نیز تنوع ژنتیکی که غیرسازگار می­باشد برای یافتن جمعیت­های مناسب در امر حفاظت مهم می­باشند (هامریک^[۹۹] و همکاران، ۱۹۹۱). بنابراین نشانگر­های مولکولی حتی اگر اطلاعات زیادی از تفاوت­های کمی و ویژگی­های سازگاری را نشان ندهند، ابزار­های مفیدی برای کاربرد تجزیه­های ژنتیکی شامل موارد زیر می­باشند:

• • تجزیه تنوع ژنتیکی گونه­ های مختلف (کوکس^[۱۰۰] و همکاران، ۱۹۸۶).

• • شناسایی والدین مختلف برای تولید نسل­های با تنوع ژنتیکی بیشتر برای انتخاب بعدی.

• • یافتن ژن­های مورد نظر هیبریدی از منابع ژنتیکی متفاوت که وجود دارد (تامپسون^[۱۰۱] و همکاران، ۱۹۹۸).

1. 1. مونیتور کردن تغییراتی که به واسطه جابجایی ایجاد می­شوند.

تعداد زیادی از نشانگر­های DNAبرای بررسی تنوع ژنتیکی داخل یک گونه وجود دارد و هر یک دارای محاسن و معایبی می­باشند. مهمترین نشانگر­های DNA با مزایا و محاسن آن­ها در زیر آمده است (مولر و ولفنبرگ^[۱۰۲]، ۱۹۹۹).
جدول ۱-۱ مهمترین نشانگر­های DNA با مزایا و محاسن آن­ها