۱۹- ستون را دور ریخته و محلول درون میکروتیوب حاوی پلاسمید استخراج شده است.
۳-۴-۵ تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده
بعد از استخراج پلاسمید - AMP⁺ pBSK که حاوی ژن C2 پروتئین ALCAM سنتز شده توسط کمپانی می باشد، با توجه به جایگاههای آنزیمی در نظر گرفته شده در ابتدا و انتهای ژن سنتز شده می توان از آن ها جهت تایید حضور ژن در پلاسمید استفاده کرد و سپس محصول هضم آنزیمی دوگانه ^[۴۹] جهت بررسی بر روی ژل آگارز برده تا قطعات مورد نظر مربوط به پلاسمید و ژن سنتز شده مشاهده شوند.
۳-۴-۵-۱ هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion
با توجه به سازه ی طراحی شده از دو آنزیم محدود کننده ی Nco1 و XhoI جهت تایید آنزیمی استفاده شد. مراحل انجام کار به شکل زیر است:
۱- ابتدا باید بافر مناسب برای هضم دوگانه آنزیم های NcoI و XhoI را انتخاب کنیم که این کار را با کمک سایت شرکت تولید کننده آنزیم ها یعنی فرمنتاز لیتوانی انتخاب می کنیم . بهترین شرایط بافری برای این واکنش بافرx2 تانگو می باشد .

۲- یک میکروتیوب ۲/۰ برمی داریم و محتویات واکنش که توسط سایت فرمانتاز انتخاب کردیم را به صورت زیر در آن مخلوط می کنیم .
آب استریل: ۱۲ میکرولیتر
بافر تنگو x2 : 4 میکرولیتر
آنزیم NcoI : 1 میکرولیتر
آنزیم XhoI : 1 میکرولیتر
پلاسمید : ۲ میکرولیتر
حجم نهایی واکنش:۲۰ میکرولیتر
۳- میکروتیوب را به مدت ۱ الی۲ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد ( دمای اپمتیموم واکنش آنزیم ها ) قرار می دهیم .
۳-۴-۵-۲ الکتروفورز
جهت جداسازی قطعات حاصل از هضم دو گانه آنزیمی از الکتروفورز استفاده می شود.
۳-۴-۵-۲-۱ تهیه بافر ۵۰x TAE
برای تهیه بافر TAE 50x از موارد زیر استفاده می بریم:
Tris : 5/60 گرم
EDTA 5/0 مولار ( در ۸ PH = ) : 25 میلی لیتر
اسید استیک: ۲۸/۱۴ میلی لیتر
آب استریل: به مقداری که حجم نهایی به ۲۵۰ میلی لیتر برسد.
حجم نهایی:۲۵۰ میلی لیتر
نکته: برای اینکه بافر ۵۰x TAE را به بافر TAE 1x مورد استفاده دربیاوریم آن را در حجم مناسب رقیق می کنیم .
۳-۴-۵-۲-۲ تهیه ژل آگارز
برای جداسازی قطعات حاصل از هضم دوگانه آنزیمی از ژل آگارز Low استفاده می کنیم . برای تهیه ی ژل ۱٫۵ درصد آگارز، ۰٫۴۵ گرم آگارز را در ۳۰ میلی لیتر از بافر TAE 1x حل می کنیم و با چرخاندن آرام ارلن به خوبی آن را مخلوط می کنیم . به مدت مناسب به کمک یک گرماساز آن را حرارت می دهیم تا کاملا ذوب شود. این عمل تا آستانه جوشیدن ژل ادامه می یابد ولی نباید به مرحله جوشیدن برسد. باید دقت شود که ژل به طور کامل حل شده و محلول کاملا شفاف شود.
پس از این که محلول آگارز به طور نسبی تا دمای ۵۰ تا ۶۰ درجه سرد شد(زمانی که دست را نسوزاند) ، رنگ گرین ویوئر^[۵۰]یا اتیدیوم برماید را به میزان ۲ میکرولیتر به آن اضافه می کنیم و به ظرف مناسب شانه دار منتقل می کنیم و در دمای محیط قرار می دهیم تا ژل سفت شود و ببندد(تقریبا ۱۵ دقیقه) . این ژل در حضور بافر TAE 1x تا یک هفته در دمای ۴ درجه قابل نگه داری است.
۳-۴-۵-۲-۳ Run کردن نمونه
پس از بسته شدن کامل ژل، آن را درون تانک قرار می دهیم به نحوی که چاهک ها به سمت قطب منفی قرار گیرند . تانک الکتروفورز را با بافر TAE 1x پر می کنیم تا حدی باشد که به طور کامل روی ژل را بپوشاند.
نمونه را با ۲میکرولیتر (loading dye) مخلوط کرده و در درون چاهک ریخته ومقدار ۲میکرولیتر از یک مارکر با وزن مولکولی kb 1 هم جهت شناسایی سایز قطعات در یکی از چاهک ها استفاده می کنیم .
تانک الکتروفورز را به منبع تولید ولتاژ وصل کرده و با ولتاژ ۱۲۰ ولت و ۵۵ آمپر الکتروفورز را انجام می دهیم .
وقتی رنگ تا حدود ۳/۲ ژل پیشرفت کرد تانک را از منبع نیرو جدا کرده و ژل را به کمک دستگاه Gel) (documentation مورد بررسی قرار می دهیم .
۳-۵ ساب کلونینگ ژن ناحیهC2 پروتئینALCAM
جهت بیان ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM از باکتری E.coli BL21(DE3) استفاده شد . ابتدا ژن مورد نظر از روی ژل اگارز مرحله الکتروفورز با بهره گرفتن از کیت خالص سازی شد و سپس به کمک تکنیک Ligation با پلاسمید pet-28a ترکیب شد . سپس این ترکیب به سلول های شایسته ی E.Coli BL21 ترانسفورم شد.
۳-۵-۱ تخلیص DNA ناحیهC2 پروتئین ALCAMاز ژل
برای تخلیص از کیت استخراج DNA از ژل تولیدی شرکت فرمنتاز لیتوانی استفاده شد. (شکل ۳-۱۱ )
شکل ۳-۱۱٫ کیت استخراج DNA از ژل فرمنتاز
روش انجام آن بصورت زیر می باشد:
۱- به کمک یک اسکالپل استریل، ناحیه ای از ژل که DNA ناحیهC2 پروتئینALCAM در آن قرار دارد را جدا کرده و به قطعات کوچک تقسیم می کنیم برای راحت ذوب شدن ژل .
۲- به ژل حاوی DNA نوترکیب ، ۴۰۰ میکرولیتر Binding Buffer در داخل یک میکروتیوب اضافه می کنیم.
۳- مخلوط را به داخل بن ماری ۵۵ درجه انتقال داده و به مدت ۵ دقیقه انکوبه می کنیم برای سهولت در ذوب شدن کامل ژل آن را هر ۲ دقیقه هم می زنیم .
۴- ۵ میکرولیتر سیلیکا به مخلوط اضافه می کنیم .
۵- ۵ دقیقه در بن ماری ۵۵ درجه قرار می دهیم تا سیلیکا به خوبی حل شود.
۶- به مدت ۱۰ ثانیه میکروتیوب را سانتریفیوژ کرده تا سیلیکا رسوب کند . محلول رویی را دور می ریزیم.
۷- ۵۰۰ میکرولیتر washing buffer به میکروتیوب اضافه کرده و به کمک ورتکس به خوبی مخلوط می کنیم.
۸- به مدت ۱۰ ثانیه میکروتیوب را سانتریفیوژ کرده و محلول رویی را دور می ریزیم.
۹- مرحله ی ۷ و ۸ را دوبار دیگر تکرار می کنیم تا تمام الکل موجود از مرحله ی قبل حذف شود ( الکل ممکن است از واکنش های آنزیمی مراحل بعدی جلوگیری کند).
۱۰- ۳۰ میکرولیتر بافر TE به رسوب اضافه کرده و ورتکس می کنیم تا کاملا با محتویات میکروتیوب مخلوط شود .
۱۱- میکروتیوب را به مدت ۵ دقیقه در ۵۵ درجه قرار می دهیم.