ﺟﺪول ۲-۵:ﺗﻌﺪادی از اﺑﺰارهای ﻣﻮﺟﻮد جهتﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B (193).

۲-۲۰-۲-۲-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B ﺑﺮ ﻣﺒﻨﺎی ﻣﯿﻞ ذاﺗﯽ آﻣﯿﻨﻮاﺳﯿﺪ

ﯾﮑﯽ از اوﻟﯿﻦ و مهمترین ﻣﻘﺎﻻت ﺗﺎﺛﯿﺮ ﮔﺬار در ﻣﻮرد ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ، مقاله ای ﺑﻮد که روش آن ﺑﺪﯾﻦ ﺻﻮرت ﺑﻮد که ﯾﮏ ﻣﻘﺪار(ﮐﻤﯿﺖ) ﻋﺪدی هیدروفیلیسیتی ﺑﺮای هر ٢٠ آﻣﯿﻨﻮاﺳﯿﺪ اﺻﻠﯽ ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ ﺳﺎز ﺗﻌﯿﯿﻦ ﻣﯽﮐﺮدﻧﺪ و ﻣﯿﺎﻧﮕﯿﻦ ﺣﺴﺎﺑﯽ هیدروفیلیسیتی ﺑﺮ روی ﭘﻨﺠﺮه ﻣﺘﻐﯿﯿﺮ ﭼﻨﺪﯾﻦ توالی در ﮔﺴﺘﺮه ﻃﻮل ﮐﻞ ﺗﻮاﻟﯽ زﻧﺠﯿﺮه ﭘﻠﯽ ﭘﭙﺘﯿﺪ ارزﯾﺎﺑﯽ ﻣﯽ ﺷﺪ و ﯾﮏ ﭘﺮوﻓﺎﯾﻞ ﺗﻮاﻟﯽ اﯾﺠﺎد ﻣﯽ نمود که قله ها ﻣﺮﺑﻮط به اپی توپ های ﻓﺮﺿﯽ ﺳﻠﻮل B ﻣﯽ ﺑﺎﺷﻨﺪ(۱۹۴). روش ها ی ﺑﺴﯿﺎر ﻣﺘﻨﻮﻋﯽ اﺑﺪاع ﺷﺪه اﻧﺪ که از ﺟﺎﯾﮕﺰﯾﻦ هاﯾﯽ ﺑﺮای ﻣﻘﺎدﯾﺮ هیدروفیلیسیتی اﺻﻠﯽ و ﻧﻤﻮدار ﻣﯿﺎﻧﮕﯿﻦ اﺳﺘﻔﺎده ﻣﯽ ﮐﻨﻨﺪ (۱۹۵). و به ﻧﻮﺑﺖ رهیافت های ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ ﺗﺮﮐﯿﺒﯽ را ﺑﺮاﺳﺎس ﺗﻮاﻓﻖ ﻣﺎﺑﯿﻦ ﭼﻨﺪﯾﻦ روش ﻣﺨﺘﻠﻒ را به ﮐﺎر ﻣﯽ ﮔﯿﺮﻧﺪ (۱۹۶).
Pellequer و همکاران ﭼﻨﺪﯾﻦ روش ﻣﻘﯿﺎس ﻣﯿﻞ ذاﺗﯽ را ﺑﻮاﺳﻄﮫ مجموعه ای از ١۴ اﭘﯽ ﺗﻮپ از ١١ ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ که به ﺧﻮﺑﯽ ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ و ﺷﺮح ﻧﻮﯾﺴﯽ ﺷﺪه ﺑﻮدﻧﺪ را ﺑﺎ ﯾﮑﺪﯾﮕﺮ ﻣﻘﺎیسه ﮐﺮدﻧﺪ و ﻣﺘوجه ﺷﺪﻧﺪ که ﻣﻘﯿﺎس هایParker و همکاران، Levitt و Emini و همکاران ﻧﺘﺎﯾﺞ بهتری را ﻧﺴﺒﺖ به ﺳﺎﯾﺮ ﻣﻘﯿﺎس های ﺑﺮرﺳﯽ ﺷﺪه ارائه ﻣﯽ دهند (۱۹۷). البته نتیجه ﮔﯿﺮی نهایی ﻣﻮﻓﻘﯿﺖ اﻧﺪﮐﯽ در اﺳﺘﻔﺎده از اﻧﻮاع ﻣﺨﺘﻠﻒ روش های اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪه در آن مقاله را ﻧﺸﺎن ﻣﯽ داد. اﻟﮕﻮرﯾﺘﻢ های ﻣﺘﻨﻮع ﻣﻮرد اﺳﺘﻔﺎده جهت ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ، از ﺗﺮﮐﯿﺒﯽ از اﯾﻦ ﺧﺼﻮﺻﯿﺎت اﺳﺘﻔﺎده ﻣﯽ ﮐﻨﻨﺪ، که در نهایت دﻗﺖ آن ها ﺣﺪود ۶٠ ﺗﺎ ٨٠ % اﺳﺖ. همچنین Kolaskar و Tangaonkar ﻣﻘﯿﺎﺳﯽ را ارائه ﮐﺮدﻧﺪ که از ﺗﺮﮐﯿﺒﯽ از هیدروﻓﻮﺑﯿﺴﯿﺘﯽ، اﻧﻌﻄﺎف ﭘﺬﯾﺮی و دﺳﺘﺮﺳﯽ ﺳﻄﺤﯽ ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ اﺳﺘﻔﺎده ﻣﯽ ﮐﺮد و به ﻧﺎم “ﻣﻘﯿﺎس ﺗﻤﺎﯾﻞ ذاﺗﯽ آﻧﺘﯽ ژﻧﯿﮏ ﺑﻮدن” ﻧﺎﻣﮕﺬاری و به ﻋﻨﻮان ﯾﮏ اﺳﺘﺎﻧﺪارد ﻃﻼﯾﯽ در ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ ﻣﻌﺮﻓﯽ ﺷﺪ که دﻗﺖ آن ﺣﺪود ٧۵% اﺳﺖ (۱۹۸). اﺑﺰار BEPITOPE اپی توپ های پیوسته را ﺑﺮ اﺳﺎس ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ ﻧﻮاﺣﯽ ﭼﺮﺧﺶ ﭘﺮوﺗﺌﯿﻨﯽ ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ ﻣﯽ ﮐﻨﺪ(۱۹۹).
ﭘﺎﯾﮕﺎه PREDITOP ﻧﺴﺒﺖ به BCIPEP که از ﺑﯿﺶ از ٣٠ نمونه از ﻣﻘﺎدﯾﺮ ﻣﻘﯿﺎس ﻣﯿﻞ ذاﺗﯽ اﺳﺘﻔﺎده ﻣﯽ ﮐﻨﺪ ﻧﺴﺨﮫ ﺟﺪﯾﺪﺗﺮی اﺳﺖ. ﺳﺮور BCEPRED اپی توپ های ﺳﻠﻮل B را ﺑﺎ ۵٨.٧% دﻗﺖ ﻣﺒﺘﻨﯽ ﺑﺮ ﺗﺮﮐﯿﺒﯽ از ﺧﺼﻮﺻﯿﺎت آﻣﯿﻨﻮاﺳﯿﺪی ﻧﻈﯿﺮ دﺳﺘﺮﺳﯽ، هیدروفیلیسیتی، اﻧﻌﻄﺎف ﭘﺬﯾﺮی، ﺳﻄﺢ در ﻣﻌﺮض و ﻧﻮاﺣﯽ ﭼﺮﺧﺶ ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ ﻣﯽ ﮐﻨﺪ (۱۹۵). آﻧﺎﻟﯿﺰ ﻣﯿﺎﻧﮑﻨﺶ های آﻧﺘﯽ ﺑﺎدی ﺑﺎ آﻧﺘﯽ ژن که در ﻧﻮاﺣﯽ اﺗﺼﺎل آﻧﺘﯽ ﺑﺎدی به آﻧﺘﯽ ژن رخ می دهد به ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ های ﻓﻀﺎﯾﯽ ﺳﻠﻮل B ﮐﻤﮏ ﻣﯽ ﮐﻨﺪ. توجه به اﯾﻦ اﻣﺮ ﺿﺮوری اﺳﺖ که ﯾﮏ ﭘﺎﯾﮕﺎه داده به ﻧﺎم http://202.41.70.51:8080/agabdb2 AGABDB توسعه یافته که ﺑﺮ ﻣﺒﻨﺎی ﻣﯿﺎﻧﮑﻨﺶ های ﻣﻮﻟﮑﻮﻟﯽ ﺳﺎﺧﺘﺎر های Co-crystal آﻧﺘﯽ ژن- آﻧﺘﯽ ﺑﺎدی ﻋﻤﻞ ﻣﯽ ﮐﻨﺪ (۱۹۸).

۲-۲۰-۲-۳-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺳﻠﻮلB ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از روش های ﯾﺎدﮔﯿﺮی ﻣﺎﺷﯿﻦ

ﭼﻨﺪﯾﻦ ﻣﺤﻘﻖ ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از اﻟﮕﻮرﯾﺘﻢ ها و اﺑﺰارهای ﯾﺎدﮔﯿﺮی، ﻣﺎﺷﯿﻦ را به جهت ﺑﺎزﯾﺎﺑﯽ ﺧﺼﻮﺻﯿﺎت ﯾﮏ اﭘﯽ ﺗﻮپ از ﻃﺮﯾﻖ ﯾﮏ دسته داده آﻣﻮزﺷﯽ اﺳﺘﻔﺎده ﮐﺮده اﻧﺪ.
ﺑﺮای ﻣﺜﺎل Saha و Raghava از ﻣﺪل شبکه های ﻋﺼﺒﯽ ﻣﺼﻨﻮﻋﯽ artificial neural networks (ANNs) در ﺳﺮور ABCPRED و Sweredoski و Baldi ﭘﺎﯾﮕﺎه COBEPRO را ارائه ﮐﺮدﻧﺪ که از ﯾﮏ support vector machine (SVM) اﺳﺘﻔﺎده ﻣﯽ ﮐﻨﺪ (۱۸۷). ﺑﺪﯾﻦ ﻣﻌﻨﯽ که Saha و Raghava از روش های ﺛﺒﺎت ﭘﯿﺸﺨﻮردی و شبکه های ﻋﺼﺒﯽ ﺗﮑﺮاری جهت ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ های ﺳﻠﻮل B اﺳﺘﻔﺎده ﮐﺮدﻧﺪ. آن ها ٧٠٠ اپی توپ های ﺳﻠﻮل B و به همین ﻣﯿﺰان ﭘﭙﺘﯿﺪ های ﻏﯿﺮ اﭘﯽ ﺗﻮﭘﯽ را از ﭘﺎﯾﮕﺎه داده SWISSPROT ﺑﺮای آﻣﻮزش و آزﻣﻮن ﺑﺮداﺷﺘﻨﺪ. همچنین COBEPRO از ﯾﮏ ﺳﯿﺴﺘﻢ دو مرحله ای ﺑﺮای ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ های پیوسته ﺳﻠﻮل B اﺳﺘﻔﺎده ﻣﯽ ﮐﻨﺪ (۱۸۷).
ﭘﺎﯾﮕﺎه COBEPRO ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ را قطعه قطعه ﮐﺮده و ﺳﭙﺲ ﯾﮏ اﻣﺘﯿﺎز ﻣﯿﻞ ذاﺗﯽ به هر قطعه جهت اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺑﻮدن ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از ﯾﮏ SVM ﻣﯽ دهد. در ﺣﺎل ﺣﺎﺿﺮ COBEPRO ﺑﺎ ﭘﺎﯾﮕﺎه SCARTCH (http://scratch.proteomics.ics.uci.edu) ﯾﮑﭙﺎرچه ﺷﺪه اﺳﺖ. به هر ﺣﺎل COBEPRO را ﻧﻤﯽ ﺗﻮان جهت ﺗﻤﺎﯾﺰ آﻧﺘﯽ ژن از ﻏﯿﺮ آﻧﺘﯽ اﺳﺘﻔﺎده ﮐﺮد. اﯾﻦ ﺳﺮور ﺑﺎﯾﺪ ﺑﺎ ﺗﮑﻨﻮﻟﻮژی های ﺑﺎ ﺑﺮون ده ﺑﺎﻻ اﺳﺘﻔﺎده ﺷﻮد ﺗﺎ اﺛﺮﺑﺨﺸﯽ آن اﻓﺰاﯾﺶ ﯾﺎﺑﺪ (۱۸۷).
Larsen و همکاران(BEPIPRED) http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred را ﻣﻌﺮﻓﯽ نمودﻧﺪ (۱۸۸) . آن ها سه دسته داده از اپی توپ هایﺧﻄﯽ ﺳﻠﻮل B ﻣﺴﺘﺨﺮج از ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ های ﺷﺮح ﻧﻮﯾﺴﯽ ﺷﺪه از ﻣﻘﺎﻻت ، ﭘﺎﯾﮕﺎه داده ANTIJEN و ﭘﺎﯾﮕﺎه داده LosAlamos به ﻧﺸﺎﻧﯽ (http://www.hiv.lanl.gov) ﺳﺎﺧﺘﻨﺪ (۱۸۸).

۲-۲۰-۲-۴-روش ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﻏﯿﺮ پیوسته ﺳﻠﻮل B

همانطور که ﭘﯿﺸﺘﺮ گفته ﺷﺪ ﺑﯿﺶ از ٩٠ % از اپی توپ هایﺳﻠﻮل B ﻏﯿﺮ پیوسته هستند، که اﯾﻦ اﻣﺮ ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ های ﻓﻀﺎﯾﯽ ﺳﻠﻮل B را ﺑﯿﺸﺘﺮ ﺑﺎ اهمیتﻣﯽ ﮐﻨﺪ. در واﻗﻊ ﯾﮏ ﻧﻮع وﯾﮋه ای از ﻣﯿﺎﻧﮑﻨﺶ های ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ- ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ در اﯾﻦ اپی توپ ها وﺟﻮد دارد و ﺗﻐﯿﯿﺮ در ﺗﺎﺧﻮردﮔﯽ ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ ﻣﻤﮑﻦ اﺳﺖ ﻣﻨﺠﺮ به ﺗﻐﯿﯿﺮ ﺗﻌﺪاد اپی توپ ها ﺷﻮد (۱۹۳). ﺗﺸﺨﯿﺺ و ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B اﺳﺎﺳﺎ وابسته به ﺳﺎﺧﺘﺎر ﻓﻀﺎﯾﯽ اﺳﺖ از اﯾﻦ رو ﭘﯿﭽﯿﺪﮔﯽ های ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ در ﻣﻘﺎیسه ﺑﺎ ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺑﺮای ﺳﻠﻮل T ﺑﯿﺸﺘﺮ اﺳﺖ. دﻗﯿﻖ ﺗﺮﯾﻦ روش جهت ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ اپی توپ های ﺳﻠﻮل B، ﮐﺮﯾﺴﺘﺎﻟﻮﮔﺮاﻓﯽ اﯾﮑﺲ اﺳﺖ. ﺑﺮای نمونه اوﻟﯿﻦ ﺳﺮور ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ ﮐﻨﻨﺪه اپی توپ هایﺧﻄﯽ و ﻓﻀﺎﯾﯽ به ﻧﺎم CEP (CEP web interface) در ﺳﺎل ٢٠٠۵ ﻣﻌﺮﻓﯽ ﮔﺮدﯾﺪ(۱۹۱). اﯾﻦ نرم افزار جهت ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ ﺷﺎﺧﺺ های آﻧﺘﯽ ژﻧﯿﮏ ﻣﺒﺘﻨﯽ ﺑﺮ ذات ۳D ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ آﻧﺘﯽ ژﻧﺘﯿﮏ از ﻣﻌﯿﺎر های ﻣﺒﺘﻨﯽ ﺑﺮ ﺳﺎﺧﺘﺎر، دﺳﺘﺮﺳﯽ آﻣﯿﻨﻮاﺳﯿﺪها به ﺣﻼﻟﯽ که در آن ﺣﻞ ﺷﺪه اﻧﺪ و آﺳﺘانه ای ﺑﺮای ﻣﯿﺰان فاصله ﻓﻀﺎﯾﯽ اﺳﺘﻔﺎده ﻣﯽ ﮐﻨﺪ. دﺳﺘﺮﺳﯽ ﻣﺤﺪود اﯾﻦ ﺳﺮور به ﺳﺎﺧﺘﺎرهای سه ﺑﻌﺪی آﻧﺘﯽ ژن های ﭘﺮوﺗﺌﯿﻨﯽ، ﮐﺎرﺑﺮد آن را ﮐﻢ ﮐﺮده اﺳﺖ. به دﻧﺒﺎل آن Bublil و همکاران، MAPITOPE را جهت نقشه ﯾﺎﺑﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B توسعه دادﻧﺪ (۱۹۳). ﻓﺮضیه که در ﭘﺲ MAPITOPE نهفته اﺳﺖ اﯾﻦ ﻣﯽ ﺑﺎﺷﺪ که ﺳﺎده ﺗﺮﯾﻦ قطعه ﻣﻌﻨﯽ دار ﯾﮏ اﭘﯽ ﺗﻮپ، ﯾﮏ ﺟﻔﺖ آﻣﯿﻨﻮ اﺳﯿﺪ از توالی هاﯾﯽ اﺳﺖ که درون اﭘﯽ ﺗﻮپ ﻗﺮار گرفته و ﺣﺎﺻﻞ ﺗﺎﺧﻮردﮔﯽ اﻧﺪ (۱۹۳).
Sollner و همکاران ﯾﮏ روش محاسبه ای ارائه ﮐﺮده اﻧﺪ که به ﻃﻮر ﺧﻮدﮐﺎر ﭘﭙﺘﯿﺪها را جهت شبیه ﺳﺎزی اﺗﺼﺎل به آﻧﺘﯽ ﺑﺎدی اﻧﺘﺨﺎب و اﻣﺘﯿﺎز دهی ﻣﯽ ﮐﻨﺪ (۲۰۰). آن ها همبستگی ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺳﻠﻮل B را ﺑﺎ ﺗﻐﯿﯿﺮ ﭘﺬﯾﺮی آﻧﺘﯽ ژن و اﻟﮕﻮهای ﻣﺤﺎﻓﻈﺖ ﺷﺪﮔﯽ ﺑﺮای ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ ﺗﻐﯿﯿﺮات ﭘﺲ از ترجمه ﺑﺮرﺳﯽ ﮐﺮدﻧﺪ و ﻣﺘﻮجه آﻧﺘﯽ ژﻧﺴﯿﺘﯽ ﺑﺎﻻ، ﺗﻐﯿﯿﺮ ﭘﺬﯾﺮی ﭘﺎﺋﯿﻦ و اﺣﺘﻤﺎل ﮐﻤﺘﺮ ﺗﻐﯿﯿﺮات ﭘﺲ از ترجمه در ﻧﻮاﺣﯽ ﻣﺮﺗﺒﻂ ﺑﺎ ﻓﻌﺎﻟﯿﺖ زﯾﺴﺘﯽ ﺷﺪﻧﺪ. ﺑﺎ ﻣﻘﺎیسه و هم ﺗﺮاز ﮐﺮدن روش های ذﮐﺮ ﺷﺪه، ﻋﻤﻠﮑﺮد بهتر SEPPA که در ﺳﺎل ٢٠٠٩ ارائه ﮔﺮدﯾﺪ، ﺣﺎﺻﻞ ﻣﯽ ﺷﻮد(۱۹۰). در ﻃﺮح رﯾﺰی اﻟﮕﻮرﯾﺘﻢ های آن ﻓﺎﮐﺘﻮرهای ﻓﻀﺎﯾﯽ ﺑﯿﺸﺘﺮی ﻣﻮرد توجهﻗﺮار گرفته اﺳﺖ (ﻧﻈﯿﺮ وﺟﻮد وﯾﮋﮔﯽ های ﺗﻮﭘﻮﻟﻮژﯾﮑﯽ و ﻣﻌﯿﺎرهای-residue triangleunits). ﺑﺮ اﺳﺎس اﯾﻦ ﻣﻄﺎﻟﻌﺎت ،EPSVR و EPMeta توسعه ﯾﺎﻓﺘﻨﺪ. EPSVR اوﻟﯿﻦ اﺑﺰاری اﺳﺖ که از روش Support Vector Regression (SVR) جهت ﯾﮑﭙﺎرچه ﺳﺎزی ﺷﺶ روش اﻣﺘﯿﺎزدهی اﺳﺘﻔﺎده ﮐﺮده اﺳﺖ. به ﻋﻼوه، ﺑﺎ ﭘﻨﺞ ﺳﺮور ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺗﺮﮐﯿﺐ ﺷﺪه ﺗﺎ EPMeta را ﺑﺴﺎزد (۱۹۷).
ﺟﺪول ۲- ۶ : ﻣﻨﺎﺑﻊ ﻣﻮﺟﻮد جهتﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮلB (184،۱۹۳)

۲-۲۰-۲-۵-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ های ﺳﻠﻮل T

اپی توپ های ﺳﻠﻮل T ﻣﻌﻤﻮﻻ به ﻃﻮر ﻏﯿﺮ ﻣﺴﺘﻘﯿﻢ به واسطه ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ ﻋﻨﺎﺻﺮ ﻣﺘﺼﻞ ﺷﻮﻧﺪه به MHC ﮐﻼس I و II ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ ﻣﯽ ﺷﻮﻧﺪ. از اﯾﻦ رو ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ ﭘﭙﺘﯿﺪهای ﻣﺘﺼﻞ ﺷﻮﻧﺪه به MHC ﺑﺨﺸﯽ اﺳﺎﺳﯽ را در ﺗﻤﺎم اﻟﮕﻮرﯾﺘﻢ های ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ ﮐﻨﻨﺪه اپی توپ های سلول های T را ﺗﺸﮑﯿﻞ ﻣﯽ دهد. در ﮐﻞ ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺑﺮای ﺳﻠﻮل T ﺑﺴﯿﺎر ﺳﺎده ﺗﺮ از ﺳﻠﻮل B ﺑﻮده و اﺑﺰارهاﯾﯽ ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ ﮐﻨﻨﺪه اپی توپ های آن ﻧﯿﺰ ﻗﺪﻣﺖ ﺑﯿﺸﺘﺮی دارﻧﺪ (۱۸۵). روش ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ ﺑﺮای MHC ﮐﻼس I و II ﺑﺎ ﯾﮑﺪﯾﮕﺮ ﻣﺘﻔﺎوت اﺳﺖ ﺑﺪﯾﻦ ﺳﺒﺐ که ﺷﯿﺎر اﺗﺼﺎﻟﯽ MHC ﮐﻼس I بسته اﺳﺖ، در ﺣﺎلیکه ﺷﯿﺎر اﺗﺼﺎﻟﯽ MHC ﮐﻼس II از هر دو ﺳﻮ ﺑﺎز اﺳﺖ که اﯾﻦ اﻣﺮ ﺳﺎزﮔﺎر ﺑﺎ ﭘﭙﺘﯿﺪ های ﺑﺎ ﻃﻮل ﻣﺘﻨﻮع (ﻋﻤﻮﻣﺎ ١٣ ﺗﺎ ٢۵آﻣﯿﻨﻮاﺳﯿﺪ) ﻣﯽ ﺑﺎﺷﺪ. همچنین ﻧﺘﺎﯾﺞ ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ ﻋﻨﺎﺻﺮ ﻣﺘﺼﻞ ﺷﻮﻧﺪه به MHC ﮐﻼس II ﺑﺎ دﻗﺖ و ﺻﺤﺖ ﺑﺴﯿﺎر ﮐﻤﺘﺮی از MHC ﮐﻼس I اﻧﺠﺎم ﻣﯽ ﺷﻮد. ﻧﺮم اﻓﺰارهای ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ ﮐﻨﻨﺪه MHC ﮐﻼس I و II دارای دﻗﺖ و درﺳﺘﯽ ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ ﻗﺎﺑﻞ ﺗﺤﺴﯿﻦ ﺑﯿﻦ ٩٠-٧٠ % ﺑﺮای ﻋﻨﺎﺻﺮ ﻣﺘﺼﻞ ﺷﻮﻧﺪه و ٨٠-۴٠% ﺑﺮای ﻋﻨﺎﺻﺮ ﻏﯿﺮ ﻣﺘﺼﻞ ﺷﻮﻧﺪه ﺑﺎ داﻣنه ﻣﺤﺪودی از ﭘﻮﺷﺶ آﻟﻠﯽ MHC و ﻃﻮل ﭘﭙﺘﯿﺪی ﺛﺎﺑﺖ ﻣﯽ ﺑﺎﺷﻨﺪ(١۸۴). در ﮐﻞ اﺑﺰارهاﯾﯽ که به ﻃﻮر اﺧﺘﺼﺎﺻﯽ ﻋﻨﺎﺻﺮ ﻣﺘﺼﻞ ﺷﻮﻧﺪه به MHC ﮐﻼس II را ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ ﻣﯽ ﮐﻨﻨﺪ به ﻧﺴﺒﺖ MHC ﮐﻼس I ﺑﺴﯿﺎر ﮐﻤﺘﺮ ﻣﯽ ﺑﺎﺷﻨﺪ و اﯾﻦ اﻣﺮ به ﺳﺒﺐ ﺧﺼﻮﺻﯿﺎﺗﯽ ذاﺗﯽ ﻓﯿﺰﯾﮑﯽ وﺷﯿﻤﯿﺎﯾﯽ ﻣﻮﻟﮑﻮل MHC ﮐﻼس II اﺳﺖ به ﻋﻨﻮان نمونه ﻣﯽ ﺗﻮان از اﺑﺰارهای MHC2Pred ،IEDB MHC II ،MHC-THREAD ،EpiDirect و ProPred ﻧﺎم ﺑﺮد. ﻣﺜﻼ در ﭘﺎﯾﮕﺎهMHC IIIEDB ﯾﮏ فهرست از چهار روش ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ ﺑﺎ ﻧﺎم های روش ﺗﻮاﻟﯽ ﻣﻮرد ﺗﻮاﻓﻖ ، ﻣﯿﺎﻧﮕﯿﻦ ﻧﺴﺒﯽ اﺗﺼﺎل ﯾﺎ ARB ،SMM ، (relative binding average ) و Sturniolo وﺟﻮد دارد (۱۸۸). به ﻃﻮر ﭘﯿﺶ ﻓﺮض بهترﯾﻦ روش در ﺑﯿﻦ اﯾﻦ روش ها در ﻧﻈﺮ گرفته ﺷﺪه اﺳﺖ. اﺑﺰارهاﯾﯽ که ﺑﺮای ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ ﻋﻨﺎﺻﺮ ﻣﺘﺼﻞ ﺷﻮﻧﺪه به هر دوی MHC ﮐﻼس I و II ﻗﺎﺑﻞ اﺳﺘﻔﺎده هستند ﻣﻌﻤﻮﻻ ﻣﺒﺘﻨﯽ ﺑﺮ روش های هیبریدی ﻣﯽ ﺑﺎﺷﻨﺪ ﯾﺎ این که ﭼﻨﺪﯾﻦ روش را ﺑﺎ هم ﯾﮑﭙﺎرچه ﮐﺮده اﻧﺪ. از اﯾﻦ ﻧﻮع اﺑﺰارهای ﻣﯽ ﺗﻮان به AntiBP ،ARB Matrix ،SVMHC ،RANKPEP و EpiVaxb اﺷﺎره کرد. روش هایی جهت پیشگویی ﭘﭙﺘﯿﺪ های ﻣﺘﺼﻞ ﺷﻮﻧﺪ به MHC کلاس I وII وﺟﻮد دارد که هر ﮐﺪام ﺑﺮ ﻣﺒﻨﺎی ﻓﺮﺿیه ای متفاوت بنیان نهاده شده اند (۱۸۵).

۲-۲۰-۳- ﮐﺎرﺑﺮدهای ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ

ﭘﯿﺎﻣﺪ ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ در ﺗﺤﻘﯿﻘﺎت ﺳﻼﻣﺖ ﻋﻤﻮﻣﯽ و ﭘﺎیه ای ﺑﺴﯿﺎر وﺳﯿﻊ اﺳﺖ و در ﺑﺴﯿﺎری از ﺗﺤﻘﯿﻘﺎت ﻣﺮﺗﺒﻂ ﺑﺎ اﭘﯽ ﺗﻮپ ﻧﻈﯿﺮ ﮐﺸﻒ ﭘﭙﺘﯿﺪ های ﺑﺮﮔﺰﯾﺪه جهت واﮐﺴﻦ های زﯾﺮ واﺣﺪی(Subunit vaccines)، مطالعه ﺑﯿﻤﺎری هایﺧﻮد اﯾﻤﻦ، درﻣﺎن اﻟﺮژی، مطالعه ﺳﺎﺧﺘﺎر ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ، ﻃﺮاﺣﯽ های ﺗﺠﺮﺑﯽ و ﻏﯿﺮه ﻣﻔﯿﺪ ﻣﯽ ﺑﺎﺷﺪ. توسعه روش ها و ﻧﺮم اﻓﺰارهای ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ جهتﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ و نقشه ﯾﺎﺑﯽ ﭘﺘﺎﻧﺴﯿﻞ اپی توپ ها در ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ آﻧﺘﯽ ژن جهت ﻣﺒﺎرزه ﺗﻤﺎم ﻋﯿﺎر ﺳﯿﺴﺘﻢ اﯾﻤﻨﯽ ﺑﺎ ﺑﯿﻤﺎری های ﻋﻔﻮﻧﯽ اﻣﺮی ﺣﯿﺎﺗﯽ اﺳﺖ. توسعه داروها ﯾﮑﯽ از ﻣﺴﺎﺋﻞ اﺻﻠﯽ و اﻧﮕﯿﺰه های اﺻﻠﯽ جهتﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ اﺳﺖ. اﯾﻤﻦ ﺳﺎزی های ﻣﺒﺘﻨﯽ ﺑﺮ اﭘﯽ ﺗﻮپ، ﻧﺘﺎﯾﺞ ﭼﺸﻤﮕﯿﺮی در ﺣﯿﻮاﻧﺎت ﻣﺪل در آزﻣﻮن های ﺑﺎﻟﯿﻨﯽ ﻧﺸﺎن داده و واﺟﺪ ﺧﺼﻮﺻﯿﺎت ﭘﯿﺸﮕﯿﺮانه، درﻣﺎﻧﯽ و ﻣﺤﺎﻓﻈﺘﯽ ﺑﻮده اﻧﺪ (۱۸۴). ﻟﺬا اﯾﻦ واﮐﺴن ﺑﺮای ﺑﯿﻤﺎری های مهم ﻧﻈﯿﺮ HCV ، HIV/AIDS و ﺳﺎﯾﺮ ﺑﯿﻤﺎری های ﻋﻔﻮﻧﯽ و ﺳﺮﻃﺎﻧﯽ ﺗﻮﻟﯿﺪ ﺷﺪه اﻧﺪ. البته در اﯾﻦ ﻣﯿﺎن ﻧﮕﺮاﻧﯽ هاﯾﯽ ﻧﯿﺰ از ﺑﺎﺑﺖ اﻣﻨﯿﺖ و ﺣﯿطه ﻋﻠﻤﯽ ﻣﻮرد اﺳﺘﻔﺎده از اﯾﻦ اﺑﺰارها وﺟﻮد دارد. زﯾﺮا که اﺑﺰارهای ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ ﮐﻨﻨﺪه اﭘﯽ ﺗﻮپ ﻣﻤﮑﻦ اﺳﺖ ﻣﻮرد ﺳﻮء اﺳﺘﻔﺎده ﺗﻮﺳﻂ ﺗﺮورﯾﺴﺖ ها جهت ﺳﺎﺧﺖ ﺳﻼح های ﺑﯿﻮﺷﯿﻤﯿﺎﯾﯽ و ﺗﺴﺮﯾﻊ ﺗﮑﺎﻣﻞ و جهش ﭘﺎﺗﻮژن ﻗﺮار ﮔﯿﺮﻧﺪ. همچنین در ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺗﻤﺎﯾﻼت ﺷﺨﺼﯽ اﻓﺮاد ﻧﯿﺰ در مرحله اﻧﺘﺨﺎب ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ جهتﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ، ﻣﺤﺪود ﺳﺎزی داﯾﺮه ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ و همچنین اﺳﺘﻔﺎده از اﺑﺰارهای ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ ﮐﻨﻨﺪه ﻣﺒﺘﻨﯽ ﺑﺮ ﻋﻤﻠﮑﺮد ﺧﺎص که ﻣﺤﻘﻖ ﺳﻌﯽ ﻣﯽ ﮐﻨﺪ آن را ﺗﺮوﯾﺞ دهد، وﺟﻮد دارد (۱۹۸).

۲-۲۱-واکسن همگانی (Universal vaccine)

در واکسن همگانی هدف این است که با بهره گرفتن از یک سری اپی توپ های Conserved بتوان پاسخ ایمنی را بر ضد ویروس اصلی، زیر نوع های آن ویروس و استرین های جدید از این ویروس القاء نمود که به جامعیتی کلی منتهی شود (۲۰۱).
آنتی بادی ها و یا پاسخ ایمنی ضد نواحی نسبتاً ثابت پروتئین های سطحی ویروس ها موجب القاء پاسخ محافظتی، حتی نسبت به گونه های نزدیک می گردد که به این فرایند Hetero or Heterosubtypic immunity اطلاق می گردد. در بررسی های انجام شده بر روی واکسن های انسانی مشخص گردید که در چنین فرایندی می توان محافظت گسترده ای (Brod protective) بر ضد ویروس مورد نظر در جمعیت ایجاد نمود (۲۰۱).

۲-۲۲- واکسن سازی معکوس Reverse Vaccinology

مفهوم Reverse vaccinology  یا واکسن سازی معکوس به فرآیندی برمیگردد که طی آن ابتدا فاکتورهای ویرولانس و اپی توپ های اصلی پاتوژن که قدرت ایمنی زایی دارند به عنوان کاندید واکسن معرفی می شوند و سپس از نظر عملکرد سیستم ایمنی و ایمنی زائی مورد مطالعه قرار می گیرند. این پروسه در پی پیشرفت های وسیعی که اخیرا صورت گرفته است ممکن می نماید بدین ترتیب که ابتدا بایستی تمام توالی ژنومی پاتوژن مورد نظر سکانس شود سپس توسط نرم افزارهای کامپیوتری ژن های کد شونده و مهم مورد شناسائی قرار می گیرند و تعداد زیادی کاندید های مناسب برای تولید واکسن معرفی می شود. پروتئین های مذکور تمامی کلون شده و پروتئین های نوترکیب تولید و در حیوان آزمایشگاهی از نظر میزان ایمنی زائی مورد بررسی قرار می گیرند. پایه این روش شناسائی اپی توپ های حیاتی و اساسی پاتوژن می باشد که می تواند پاسخ دلخواه ایمونولوژیک مدنظر ما را ایجاد نماید. امروزه حجم وسیعی از اطلاعات برگرفته از سکانس پروتئینی، ساختار RNA، فانکشنال ژنومیک و پروتئومیک تمامی یاری رسان نتایج بهتر برای تولید واکسن های دلخواه هستند (۲۰۲).

حتی شناسائی اپی توپ های پیوسته و غیر پیوسته، اپی توپ های مقلد و پیچش های نهائی پروتئین در محیط نیز مد نظر قرار گرفته و مورد پیش بینی قرار می گیرد. شناسائی نواحی متصل شونده به MHC نیز در این میان حائز اهمیت می باشد. در حال حاضر مطالعات فراوانی از این دست درحال اقدام می باشد بلاخص مطالعات بر روی مننگوکوک های گروه B که باعث تولید واکسنی درخور در این جهت شده است. و یا درحال حاضر یکی از بزرگترین مطالعات تاریخ واکسن سازی برای تولید واکسنی مناسب برای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در حال انجام است.  مطالعاتی برای تولید واکسن برای سیفلیس، مالاریا، کلامیدیا، پنوموکوک، استرپتوکوک ها، پسودوموناس، بورلیا، ریکتزیا و بارتونلا در حال انجام است.از برگترین مشکلات این روش این است که ساختارهای پلی ساکاریدی که در ایجاد ایمنی بواسطه سلول T حائز اهمیت هستند قابل بررسی نیستند چون سکانس ژنومی برای پلی ساکاریدها وجود ندارد، درثانی همیشه مدل حیوانی مناسب برای بررسی ایمنی زائی از معضلات این روش بوده است (۲۰۲).

۲-۲۳-ادجوانت ها

به دلیل پائین بودن قدرت ایمنی زایی واکسن های طراحی شده، کاربرد ادجوانت ها ضروری به نظر می‌رسد. ایده کاربرد ادجوانت ها در تقویت ایمنی زایی واکسن ها به دهه‌ های ابتدائی قرن بیستم بر می‌گردد.
در تحقیقات صورت گرفته در دهه ۱۹۲۰ در زمینه تولید سرم حیوانی جهت درمان انسان مشخص شد که اگر مواد خاصی بخصوص نمک های آلومینیوم به آنتی ژن اضافه گردند یا با آنتی ژن به حالت محلول درآیند به شدت تولید آنتی بادی را افزایش می دهد، به عبارت دیگر همچون ادجوانت عمل می کنند. هیدروکسید آلومینیوم ( آلوم ) هنوز ماده ای است که به طور وسیع همراه با توکسوئید های دیفتری و کزاز مورد استفاده قرار می گیرد و قابل اعتماد ترین ادجوانت جهت مصارف انسانی می باشد. این ادجوانت جزء ادجوانت های غیر ارگانیک است. نمک های آلومینیوم جزء نمک های رایج در واکسن ها هستند که در ایالت متحده امریکا به فروش می رسند و بیش از ۷۰ سال به عنوان ادجوانت کاربرد داشته اند. در ایمونولوژی ادجوانت ها به عنوان ماده‌ای هستند که سیستم ایمنی را تحریک کرده و بدون هیچگونه اثر آنتی ژنیک اختصاصی پاسخ واکسن را افزایش می دهند (۲۰۳).
لفظ ادجوانت از لفظ لاتین adiuvant به معنای کمک (helporaid) گرفته شده است. در اصل ادجوانت تسریع کننده پاسخ های ایمنی اختصاصی آنتی ژن و به تقویت بخشیدن به آن و یا دوام مدت زمان آن می شود، که در ترکیب (combination) با آنتی ژن‌های اختصاصی واکسن مورد استفاده قرار می گیرد. ادجوانت ها عمل خودشان را توسط تقلید از مولکول هایی که تحت عنوان evolutionarily conserved molecules در میکروب ها که PAMP نامیده می شوند، نظیر میکروزوم ها، لیپوپلی ساکارید و ترکیباتی در دیواره باکتری و dsRNA وssRNA وDNA محتوی CpG غیر متیله، انجام می دهند (۲۰۳). از آنجایی که سیستم ایمنی به شکلی تکامل یافته است که آنتی ژن های اختصاصی را شناسایی کند مخلوط یک ادجوانت با واکسن ها، پاسخ های ایمنی ذاتی به آنتی ژن را توسط تقویت عملکرد سلول های دندریتیک (DC)، لنفوسیت ها و ماکروفاژها به صورت تقلید از عفونت طبیعی، تقویت می کند . ادجوانت ها به چند گروه تقسیم می شوند:۱- ادجوانت های In organic نظیر نمک های آلومینیوم،۲- ادجوانت های ارگانیک نظیر ترکیب squalene که بیشتر در واکسن های حیوانی رایج هستند.۳- Oil-based، نظیر CFA و IF.4- Virosomes که شامل یک هم آگلوتینین متصل به غشا و نورآمینیداز مشتق از ویروس آنفلوآنزا می باشد.۵- لیگاندهای Toll-like receptor (204).
ادجوانت کامل فروند (CFA) یک محلول از آنتی ژن است که در روغن معدنی emulsifed شده و به عنوان یک عامل تقویتی استفاده می‌شود. این ادجوانت مایکوباکتریوم غیرفعال یا کشته شده است (معمولاً مایکوباکتریوم توبرکلوزیس)، در حالی که فرم ناکامل آن یا IFA اجزای مایکوباکتریوم را ندارد و صرفا امولوسیون آب در روغن معدنی است که نام این ادجوانت ازJules T.Freund گرفته شده است.CFA در تحریک ایمنی سلولی موثر است وممکن است که به تقویت تولید ایمونوگلوبولین های خاصی منجر شود ولی این تاثیر بستگی به مدل حیوانی دارد که مورد استفاده قرار می گیرد. استفاده از این ادجوانت به علت توکسیسیتی در انسان مجاز نمی باشد. حتی استفاده از این ادجوانت در حیوانات نیز بسته به نوع استفاده از آن مقررات و قوانینی دارد و دلیل آن این است که واکنش این ادجوانت در بدن دردناک است و می تواند منجر به تخریب بافتی گردد. تزریق CFA بایستی به صورت زیرپوستی (SC) و یا داخل صفاقی (IP) باشد. به دلیل اینکه تزریقات داخل پوستی (ID) ممکن است موجب ایجاد اولسر و نکروز شود و تزریق داخل عضلانی (IM) آن می تواند منجر به زخم عضلانی موقت یا دائم گردد و در حالت تزریق داخل وریدی ،ممکن است باعث ایجاد آمبولیسم لیپیدی ریوی (pulmonary lipid embolism)شود.CFA منجر به تحریک فاکتور نکروز دهنده تومور نوکروزیس (TNF) نیز می شود (۲۰۵).
با درک جدید از فرآیندهایی که منجر به تحریک لنفوسیت‌ها و ایجاد سلول های خاطره‌ای می‌گردند تلاش قابل ملاحظه ای جهت تولید ادجوانت های بهتر مخصوصا برای پاسخ های با واسطه سلول T صورت گرفته است. اما باید تاکید کرد که هنوز هیچکدام از ادجوانت‌های جدید جهت استفاده معمول در انسان مورد پذیرش قرار نگرفته اند. ادجوانت ها در مکانسیم، رفتار و هم چنین از نظر ماهیت بسیار متنوع هستند و از این رو از لحاظ طبقه بندی گروه هتروژن و بزرگی را تشکیل می دهند (۲۰۵) .
مثلا در برخی طبقه بندی ها ادجوانت ها را بر اساس عملکرد به سه دسته ۱) ادجوانت های محرک سیستم ایمنی ۲ ) ادجوانت های حامل ۳ ) ادجوانت های سیستم تحویل دهی واکسن تقسیم می نمایند . در برخی موارد ادجوانت ها به دو دسته ۱ ) پلاریزان ۲ ) غیر پلاریزان تقسیم می نمایند. که این تقسیم بندی مرتبط با اثرات ایمونو مودلاتوری ادجوانت ها می باشد. مثلا اگر ادجوانتی قادر به القای پاسخ های Th1 و یا Th2 باشد در گروه ادجوانت های پلاریزه کننده پاسخ های ایمنی قرار می گیرد. اما اگر یک ادجوانت نتواند الگوی پاسخ ایمنی را تغییر دهد از نوع ادجوانت ها ی غیر پلاریزان تقسیم بندی می گردد (۲۰۵).
امروزه با پیدایش نانو ذرات و هم چنین ژن های محرک سیستم ایمنی که به ادجوانت های ژنتیکی معروف می باشند گسترده ادجوانت ها هم چنان رو به فزونی می باشد و در واقع با پیدایش ادجوانت های نسل جدید دیگر یک تقسیم بندی منسجم و فراگیر نمی توان برای ادجوانت ها قائل شد ( ۲۰۶).
ادجوانت‌ها با مکانیسم های متنوعی پاسخ های ایمنی ضد واکسن ها را بهبود می بخشند ازجمله (۲۰۶):

• • تحریک سلول های سیستم ایمنی و افزایش ترافیک سلولی به منطقه

• • تحریک و بلوغ سلول های عرضه کننده آنتی ژن و افزایش بیان مولکول های کمک تحریکی و سایتو کاین های التهابی در آن ها

• • رسوب دهی آنتی ژن و افزایش مدت زمان مجاورت سیستم ایمنی با آنتی ژن

• • افزایش تکثیر غیر اختصاصی لنفوسیت ها ی سیستم ایمنی

• • افزایش بقای لنفوسیت های اختصاصی واکسن ( سلول های خاطره ای )

• • افزایش ورود آنتی ژن به سلول های سیستم ایمنی ، خصوصا سلول های عرضه کننده آنتی ژن

• • القای شیفت سایتو کاینی مناسب (Th 1/Th2 ) برای واکسن

• • تحریک اختصاصی زیر جمعیت های لنفوسیتی

• • تمایز سلول های پیش ساز به سلول های عرضه کننده توانمند در موضع

• • تحویل دهی کارا و موثر آنتی ژن به سلول های سیستم ایمنی

• • کاهش مقدار آنتی ژن مورد نیاز

• • افزایش پاسخ های سیستم ایمنی به واکسن (۲۰۶) .

۲-۲۴-به دست آوردن قطعه DNA یاژن مورد نظر

قطعه DNA یا ژن مورد نظر را می توان از ژنوم کامل یک موجود با بهره گرفتن از آنزیم‌های محدودکننده تهیه کرد. همچنین اگر توالی DNA مورد نظر مشخص باشد، می توان از طریق PCR آن را تکثیر کرد (۲۰۷).

۲-۲۵-کلونینگ ژن

کلونینگ ژن یعنی تولید مقادیر کافی از آن ژن خاص به صورت خالص. با کلون کردن ژن مورد نظر را از داخل یک ژنوم بزرگ به داخل یک حامل ساده و کوچک منتقل می کنیم. کلونینگ از طریق آنزیم های محدودکننده و لیگاز انجام می گیرد (۲۰۷).